王文紅，張碧麗，劉艷，劉妍，趙林勝

ACTH聯(lián)合槐杞黃對大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響

王文紅，張碧麗，劉艷，劉妍，趙林勝

摘要:目的研究促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）聯(lián)合槐杞黃對大鼠下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的影響。方法50只大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組（A組）、潑尼松模型組（B組）、槐杞黃組（C組）、ACTH組（D組）和聯(lián)合治療組（E組），每組10只。B～E組采用醋酸潑尼松水溶液12.5 mg/（kg·d）連續(xù)灌胃4周建立HPA軸抑制模型，A組以蒸餾水10 mL/（kg·d）灌胃作為對照。C、E組每次在醋酸潑尼松灌胃后30 min加用槐杞黃顆粒5 g/（kg·d）灌胃。實驗第3周時，D、E組加用ACTH 200μg/（kg·d）皮下注射。分別于實驗開始前、實驗2周、4周時測定各組血清皮質(zhì)醇水平。實驗結束后處死動物并摘取垂體和腎上腺，稱質(zhì)量后計算臟器指數(shù)，HE染色觀察垂體和腎上腺的病理情況。結果實驗2周后，B、C、D、E組的血清皮質(zhì)醇水平較A組明顯降低（P<0.05），提示造模成功。實驗4周時，C、D、E組的血清皮質(zhì)醇水平較B組均明顯升高（P<0.05），且各治療組之間E組>D組>C組（P<0.05）；同時3組的垂體和腎上腺的質(zhì)量及臟器指數(shù)均較B組升高（P<0.05）。HE染色顯示各組垂體遠側部未見明顯改變；B組腎上腺皮質(zhì)束狀帶結構變薄且紊亂，C、D、E組則出現(xiàn)不同程度的增生，以E組最為明顯。結論ACTH聯(lián)合槐杞黃可促進腎上腺皮質(zhì)束狀帶增生及皮質(zhì)醇的分泌，減輕糖皮質(zhì)激素對大鼠HPA軸的抑制作用。

關鍵詞:促腎上腺皮質(zhì)激素；槐杞黃；下丘腦-垂體-腎上腺軸；皮質(zhì)醇；垂體；腎上腺；臟器指數(shù)；大鼠，Wistar；HE染色

基金項目：天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)、中西醫(yī)結合科研專項課題（13127）

作者單位：天津市兒童醫(yī)院腎內(nèi)科（郵編300134）

作者簡介：王文紅（1966），女，主任醫(yī)師，副教授，主要從事小兒腎臟病研究

兒童原發(fā)性腎病綜合征（Primary nephrotic syn? drome，PNS）是兒童泌尿系統(tǒng)的常見疾病之一，臨床主要以糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid，GC）治療為主，劑量大且療程較長［1］。有研究指出，長期使用外源性GC可對患兒下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamic pi?tuitary adrenal，HPA）軸產(chǎn)生抑制，導致疾病頻繁復發(fā)及產(chǎn)生激素依賴［2-3］。促腎上腺皮質(zhì)激素（Adre?nal cortical hormone，ACTH）是腦垂體分泌的一種多肽類激素，能促進腎上腺皮質(zhì)束狀帶的增生及皮質(zhì)醇的分泌；通過補充外源性ACTH，可減輕對HPA軸的抑制作用?；辫近S是由槐耳菌質(zhì)、枸杞子、黃精三味藥組成，其主要活性成分為槐耳菌質(zhì)多糖，能提高機體免疫力，通過內(nèi)源性的免疫平衡等作用，維持機體內(nèi)分泌免疫狀態(tài)的穩(wěn)定。目前研究發(fā)現(xiàn)槐杞黃對腎病綜合征有一定的輔助治療作用［4］，但對HPA軸的影響尚不清楚。本實驗旨在觀察ACTH聯(lián)合槐杞黃對大鼠HPA軸的影響，為臨床治療PNS提供參考。

1　材料與方法

1.1實驗動物及試劑健康雄性SPF級Wistar大鼠50只，體質(zhì)量（220±10）g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。醋酸潑尼松片（5 mg/片）購自天津力生制藥股份有限公司，批號：1409077?；辫近S顆粒（還爾金，10 g/袋）購自啟東蓋天力藥業(yè)有限公司，批號：EA05。ACTH 1-39（10 mg/支）購自PEPTIDE SCIENCES，批號：4365。皮質(zhì)醇檢測試劑盒購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2實驗分組及給藥50只大鼠適應性喂養(yǎng)3 d，按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組（A組）、潑尼松模型組（B組）、槐杞黃組（C組）、ACTH組（D組）和聯(lián)合治療組（E組），每組10只。每日上午8：00前，B、C、D、E組采用醋酸潑尼松水溶液12.5 mg/（kg·d）灌胃，A組采用10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃4周；C、E組在潑尼松水溶液灌胃后30 min采用槐杞黃顆粒5 g/（kg·d）灌胃，實驗共4周。第3周時，D、E組加用ACTH 200μg/（kg·d）皮下注射。實驗期間，每3天稱1次大鼠體質(zhì)量，以調(diào)整藥物劑量。

1.3觀察指標

1.3.1一般狀況觀察實驗期間觀察各組大鼠的生長發(fā)育、外觀、反應性、活動性、食欲、攝食量及體質(zhì)量變化等。

1.3.2血清皮質(zhì)醇檢測分別于實驗開始前，實驗2周、4周時，各組大鼠取血（實驗開始前及實驗2周時眼內(nèi)眥取血，4周時股動脈取血），采用電化學發(fā)光法檢測血清皮質(zhì)醇水平。

1.3.3臟器指數(shù)測定實驗結束時，各組大鼠稱質(zhì)量、取血后，立即處死并摘取垂體及腎上腺，去除腎上腺被膜周圍脂肪組織及結締組織，稱質(zhì)量后計算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.3.4HE染色摘取的大鼠雙側腎上腺及垂體用10%福爾馬林溶液固定，進行常規(guī)HE染色［5］，觀察病理情況。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，符合正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較時方差齊性者采用LSD-t法，方差不齊者采用Dunnett’s T3法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1一般狀況觀察實驗過程中，A組大鼠生長發(fā)育良好，皮毛光亮，反應靈敏，活動靈活，食欲好，攝食正常；B組大鼠生長發(fā)育差，毛發(fā)無光澤、蓬亂、容易脫落，反應遲鈍，攝食較差；C、D組大鼠生長發(fā)育中等，毛發(fā)無光澤、蓬亂，反應較差，攝食可，無感染死亡等；E組大鼠生長發(fā)育較好，毛發(fā)稍有光澤，無蓬松狀，反應較靈敏，食欲可，無明顯不良反應。

2.2血清皮質(zhì)醇水平實驗2周時，B、C、D、E組血清皮質(zhì)醇含量明顯低于A組（P<0.05），提示造模成功。4周時C、D、E組血清皮質(zhì)醇水平依次升高，且均高于B組（P<0.05），見表1。

Tab.1　Comparison of serum levels of cortisol at different time points between five groups of rats表1　各組大鼠不同時段血清皮質(zhì)醇水平比較（n=10，nmol/L，±s）

Tab.1　Comparison of serum levels of cortisol at different time points between five groups of rats表1　各組大鼠不同時段血清皮質(zhì)醇水平比較（n=10，nmol/L，±s）

＊＊P<0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，d與D組比較，P<0.05

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2.3各組體質(zhì)量、垂體指數(shù)及腎上腺指數(shù)變化實驗結束后，C、D、E組大鼠垂體、腎上腺質(zhì)量及相應臟器指數(shù)均較B組升高（P<0.05），但C、D、E組間垂體指數(shù)、腎上腺指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

Tab.2　Comparison of body weight，pituitary and adrenal index between five groups of rats表2　各組大鼠體質(zhì)量及垂體、腎上腺指數(shù)比較（n=10，±s）

Tab.2　Comparison of body weight，pituitary and adrenal index between five groups of rats表2　各組大鼠體質(zhì)量及垂體、腎上腺指數(shù)比較（n=10，±s）

＊＊P<0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，P<0.05

組別A組B組C組D組E組F體質(zhì)量（g）319.20±25.32 259.00±27.47a231.80±35.34a200.40±45.04abc227.30±20.00ab20.07＊＊垂體質(zhì)量（mg）8.50±0.71 7.70±0.82a8.80±0.79b9.10±0.74b9.00±0.82b5.26＊＊腎上腺質(zhì)量（mg）46.20±1.03 36.20±3.19a45.20±1.99b47.00±1.70b47.50±1.72bc51.99＊＊垂體指數(shù)（×10-6）26.68±1.81 29.96±4.06 38.38±3.57ab46.86±7.70ab39.73±3.35ab31.62＊＊腎上腺指數(shù)（×10-6）145.44±10.26 140.49±12.32 198.45±26.08ab243.89±47.87ab210.25±17.17ab27.66＊＊

2.4HE染色各組垂體遠側部未見明顯改變。腎上腺HE染色可見A組腎上腺皮質(zhì)球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶及髓質(zhì)結構顯示清楚；B組皮質(zhì)束狀帶結構紊亂、模糊不清；C、D、E組腎上腺皮質(zhì)均具有不同程度的增生，見圖1。

Fig.1　Pathological results of adrenal gland in five groups（HE，×200）圖1　各組腎上腺病理結果（HE，×200）

3　討論

近年來，國內(nèi)外對ACTH治療腎病的研究逐漸增多，如在特發(fā)性膜性腎?。?］、局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥（Focal segmental glomerular sclerosis，F(xiàn)SGS）［7］和免疫抑制劑治療失敗的難治性腎?。?］及其他腎小球疾?。?］等。黃建萍等［10］發(fā)現(xiàn)，ACTH對頻繁復發(fā)及激素依賴的PNS患兒有一定療效，可避免長期GC治療的不良反應。槐杞黃顆粒既益氣又滋陰，益五臟之精氣，滋臟腑之陰津，對整體之虛弱具有照顧全面、強壯補養(yǎng)之功效，且具有免疫調(diào)節(jié)功能［11］。筆者前期研究顯示，不同類型的中效GC對PNS患兒腎上腺皮質(zhì)功能均有影響，其中潑尼松的抑制作用較曲安西龍及甲潑尼龍持久［12］。因此，本實驗選用潑尼松制作大鼠HPA軸抑制模型，進而觀察ACTH聯(lián)合槐杞黃對大鼠HPA軸的影響。

既往研究表明，PNS患兒在大劑量持續(xù)應用GC過程中，患兒血清皮質(zhì)醇水平下降［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，實驗2周時各治療組大鼠血清皮質(zhì)醇水平均較對照組降低，出現(xiàn)明顯的HPA軸的抑制作用，提示造模成功，與上述報道相一致。實驗4周時，槐杞黃組、ACTH組、聯(lián)合治療組較潑尼松模型組血清皮質(zhì)醇水平升高，提示槐杞黃、ACTH以及聯(lián)合治療均可減輕HPA軸的抑制作用，其中聯(lián)合治療組效果最好，槐杞黃作用較弱。另外本研究顯示槐杞黃組、ACTH組、聯(lián)合治療組大鼠垂體、腎上腺的質(zhì)量及臟器指數(shù)均較潑尼松模型組升高，但各治療組臟器指數(shù)之間差異無統(tǒng)計學意義；同時各組大鼠垂體HE染色發(fā)現(xiàn)其遠側部分泌ACTH部位均無明顯病理改變，這可能與實驗時間較短或者是對垂體的改變本身就不顯著有關。腎上腺的病理染色結果發(fā)現(xiàn)各治療組都不同程度減輕了腎上腺皮質(zhì)束狀帶的進一步萎縮，其中聯(lián)合治療組改善較為明顯，提示槐杞黃和ACTH對維持腎上腺的正常功能有一定作用。

本實驗從功能和形態(tài)兩方面研究表明槐杞黃聯(lián)合ACTH可改善大劑量GC對大鼠HPA軸的抑制作用，可在一定程度上促進受到抑制的垂體和腎上腺皮質(zhì)束狀帶的增生和分泌，為臨床上治療HPA軸抑制提供了實驗基礎。鑒于本實驗樣本數(shù)量較少，今后可進一步擴大樣本量，增加研究內(nèi)容，更詳細地闡述其作用機制。

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（2015-12-09收稿2016-02-23修回）

（本文編輯胡小寧）

中圖分類號：R72

文獻標志碼:A

DOI：10.11958/20150278

Effects of ACTH combined with Huaiqihuang on rat hypothalamic pituitary adrenal axis

WANG Wenhong,ZHANG Bili,LIU Yan,LIU Yan,ZHAO Linsheng
Department of Nephrology,Tianjin Children’s Hospital,Tianjin 300134,China

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of adrenocorticotropic hormone(ACTH）combined with Huaiqihuang on hypothalamic pituitary adrenal(HPA)in rats.MethodsFifty rats were randomly divided into five groups according to the random number table method:normal control group(group A),prednisone group(group B),Huaiqihuang group(group C), ACTH group(group D)and combined treatment group(group E)with 10 rats in each group.Rats in group B,C,D and E were gavaged by acetic acid prednisone water solution 12.5 mg/(kg·d)for 4 weeks to establish HPA axis suppression model. Group A was given distilled water 10 mL/(kg·d)as control.Rats in group C and E were gavaged with Huaiqihuang 5 g/(kg·d) 30 minutes after intragastric administration of prednisone acetate.At the third week of the experiment,group D and E were subcutaneous injected with ACTH 200μg/(kg·d).The serum cortisol levels were measured respectively at the start of the ex?periment,2 weeks and 4 weeks of experiment.Animals were sacrificed at the end of the experiment,and then weights of the pituitary,adrenal glands and the viscera index were calculated.The pathological changes of the pituitary and adrenal glands were observed by HE stainning.ResultsAfter 2 weeks,the serum cortisol levels were significantly lower in group B,C,D and E than those of group A(P<0.05),suggesting that the model was successful.After 4 weeks,the serum cortisol levels were significantly higher in group C,D and E than those of group B(P<0.05),and between the treatment group the value was group E>group D>group C(P<0.05).At the same time,the weights of pituitary and adrenal gland and the viscera in?dex were higher in the three groups than those of B group(P<0.05).The HE staining showed that there were no significant changes in the distal part of the pituitary gland in five groups.The adrenal cortex zona was thinning and the structure was dis?ordered in group B.There were different degrees of hyperplasia in group C,group D,and group E,which was the most obvi?ous in group E.ConclusionACTH combined with Huaiqihuang can promote adrenal cortex zona hyperplasia and cortisol secretion,which reduces the glucocorticoid induced inhibition of HPA axis in rats.

Key words:adrenoc orticotropic hormone;Huaiqihuang;hypothalamic pituitary adrenal;cortisol;pituitary gland; adrenal glands;viscera index;rats,Wistar;hematoxylin-eosin stain