庹媛媛， 尚魯俊, 夏海雄, 何志旭，4**， 舒莉萍,,4**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科教研室， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室， 貴州 貴陽　550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 貴州 貴陽　550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心， 貴州 貴陽　550004)

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band3基因在斑馬魚早期胚胎中的表達(dá)*

庹媛媛1， 尚魯俊2, 夏海雄3, 何志旭1，4**， 舒莉萍2,3,4**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室， 貴州 貴陽550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 貴州 貴陽550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 用band3基因的反義mRNA探針進(jìn)行斑馬魚全胚胎原位雜交，檢測band3基因在野生型Tüebingen斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)。方法： Trizol法提取斑馬魚胚胎總RNA并設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT-PCR法擴(kuò)增band3基因cDNA編碼區(qū)片段；通過基因重組技術(shù)構(gòu)建PBSK-band3重組質(zhì)粒，用BamHⅠ酶切得到線性化PBSK-band3；以T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄合成反義地高辛標(biāo)記的band3 RNA探針，用全胚胎原位雜交法檢測band3基因在斑馬魚胚胎早期的表達(dá)情況。結(jié)果： 成功克隆band3基因片段，構(gòu)建PBSK-band3重組質(zhì)粒；經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得地高辛標(biāo)記的反義band3 mRNA探針，原位雜交后檢測證實(shí)band3基因在斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中間細(xì)胞群(ICM)和主動(dòng)脈性腺中腎區(qū)(AGM)呈現(xiàn)高表達(dá)。結(jié)論： 地高辛標(biāo)記的反義band3 mRNA探針可檢測到斑馬魚胚胎中band3基因的定位表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]斑馬魚； 胚胎； band3； 全胚胎原位雜交； 探針

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生型Tüebingen斑馬魚品系由上海生命科學(xué)院健康研究所劉廷析研究員饋贈，本實(shí)驗(yàn)室繁殖培育。養(yǎng)殖條件：(28±2)℃，帶有過濾系統(tǒng)的循環(huán)水系統(tǒng)養(yǎng)殖，12 h/d光照,予以草履蟲及蝦卵飼養(yǎng)[7]。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑大腸桿菌Elico如DH5α由本課題組保存，PBSK質(zhì)粒載體由上海生命科學(xué)院健康研究所劉廷析饋贈，Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑First.strand plus購自Invitrogen公司，高保真KOD-Plus PCR酶購自TOYOBO公司，限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I、T4 DNA連接酶以及DNA Marker均購自Fermentas公司，質(zhì)粒小抽試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，地高辛RNA標(biāo)記和檢測試劑盒以及NucAwaylM Spin Columns購自Ambion公司，BCIP/NBT購自VECTORLab。測序由北京諾賽公司進(jìn)行。

1.1.3引物根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫提供的斑馬魚band3基因全長。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增編碼區(qū)片段的PCR引物。 PCR引物由京諾賽生物科技有限公司合成。上游引物P1為 5′-CGCGGATCCATTAAACGCCGCTACAAGCATTACC-3′，下游引物P2為5′ -CCGGAATTCGACGATCAGCCACATGCCCAC-3′；上游引物在起始密碼ATG前下游引物在終止密碼TAA前分別加入EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)。

1.2方法

1.2.1斑馬魚胚胎總RNA提取取斑馬魚胚胎,選取受精后0、18、24、36、48、72、96和120 h(hour post fertilization,hpf)的斑馬魚胚胎，各20枚，加入0.15 mL TRlzol試劑，充分勻漿。將斑馬魚8個(gè)時(shí)相胚胎的TRlzol勻漿室溫放置5 min，4 ℃,12 000 r/min離心10 min后將勻漿并成1管，室溫放置5 min,然后每毫升TRIzol試劑加入0.2 mL氯仿。劇烈振蕩15 s，室溫放置2 min。4 ℃,12 000 r/min離心15 min。轉(zhuǎn)移上層水相至新的離心管中。加入0.5 mL的預(yù)冷的異丙醇，室溫放置15 min沉淀RNA。4 ℃,12 000 r/min離心10 min。棄上清。加入1 mL 75%的乙醇。充分洗滌沉淀，4 ℃,12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入1 mL預(yù)冷的75% DEPC無水乙醇，4 ℃,750 g/min離心5 min,棄上清。加入1 mL預(yù)冷的75% DEPC 無水乙醇，4 ℃,750 g/min離心5 min,棄上清。4 ℃,750 g/min離心5 min。棄多余的上清液。置空氣中干燥(5～10 min)，沉淀溶于DEPC水中。

1.2.2擴(kuò)增band3片段參考Thermo試劑盒說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,以此cDNA第一鏈作為模板.進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 8 min(95 ℃ 40 s、56.4 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s)，35個(gè)循環(huán)，68 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,按北京天根生化科技有限公司的割膠回收試劑盒說明書操作回收300 bp左右的目的條帶。

1.2.3band3表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定將割膠回收的band3 PCR產(chǎn)物和PBSK載體分別用EcoRI和BamHI酶酶切。通過T4連接酶將band3和PBSK載體連接重組，并送往北京賽諾公司進(jìn)行測序鑒定。將測序正確的PBSK-band3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α宿主菌。經(jīng)單克篩選后挑取單克隆，并提取質(zhì)粒用EcoRI、BamH I進(jìn)行雙酶切鑒定。見圖1。

圖1　構(gòu)建PBSK-band3重組質(zhì)粒示意圖Fig.1　Schematic diagram of PBSK-band3 recombinant plasmid

1.2.4地高辛標(biāo)記的band3基因反義mRNA的制備將經(jīng)測序和酶切鑒定正確的PBSK-band3重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI酶酶切線性化之后，通過T7反義逆轉(zhuǎn)錄聚合酶制備反義band3基因反義mRNA 探針。用NucAwaylM Spin Columns純化吸附柱回收Band3反義mRNA探針，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5斑馬魚全胚胎原位雜交(whole mount in situ hybridization，WISH)收集Tuebingen野生型斑馬魚受精后0.75、3.75、6、9、12、18 、24、30、36、48和72 hpf共11個(gè)不同時(shí)相的胚胎，用3%多聚甲醛固定。用l×PBST溶液洗去多聚甲醛，用甲醇進(jìn)行梯度脫水后，將胚胎置于68 ℃雜交爐中進(jìn)行預(yù)雜交1 h，加人制備好的地高辛標(biāo)記的band3反義mRNA探針，于68 ℃雜交爐中過夜，用不同濃度的SSCT將多余的探針洗去，加入地高辛抗體后過夜，用MABT將多余的抗體洗掉，加入BCIP/NBT染液對雜交胚胎進(jìn)行染色，體視顯微鏡下觀察并記錄，用固定液對雜交胚胎進(jìn)行再固定并且照相。

2結(jié)果

2.1band3基因擴(kuò)增

可見到一特異性擴(kuò)增帶，位于200～500 bp，大小與預(yù)期的342 bp相符，見圖2。

注： 1為DNA Maker，2為band3 PCR產(chǎn)物，3為空白對照圖2　band3基因擴(kuò)增Fig.2　hoxd3 gene amplification

2.2PBSK-band3重組質(zhì)粒酶切鑒定與測序

用EcoR I和Xba I雙酶切得到的band3基因片段約 300 bp，與RT-PCR產(chǎn)物大小一致；另外，得到的另1個(gè)DNA片段約3 000 bp，與PBSK質(zhì)粒大小一致。 PBSK-band3重組質(zhì)粒測序與band3基因完全一致。見圖3、圖4。

2.3地高辛標(biāo)記的band3 反義mRNA探針的制備

將經(jīng)BamH I單酶切的PBSK-band3重組質(zhì)粒經(jīng)地高辛標(biāo)記后經(jīng)T7逆轉(zhuǎn)錄成功制備反義mRNA探針，見圖5。

2.4斑馬魚全胚胎原位雜交結(jié)果

Tuebingen野生型斑馬魚18～24 hpf胚胎的中中間細(xì)胞區(qū)(ICM,藍(lán)色箭頭所示)，30～48 hpf主動(dòng)脈性腺中腎區(qū)(AGM,紅色箭頭所示)有藍(lán)黑色陽性雜交信號band3 基因的表達(dá)。見圖6。

3討論

本實(shí)驗(yàn)利用斑馬魚這種模式生物研究band3基因，斑馬魚具有體積小，繁殖迅速，胚胎透明，可以實(shí)現(xiàn)目的基因的可失蹤觀察等生物學(xué)特點(diǎn)，是作為研究血液疾病研究的理想模式生物[8]。

WISH可以整體水平反映特定基因在胚胎發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)情況，是研究胚胎發(fā)育過程中調(diào)控基因表達(dá)的常用技術(shù)。該技術(shù)成熟，地高辛所標(biāo)記的探針具有較高靈敏度[9-10]，本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)斑馬魚band3基因片段的引物，提取斑馬魚胚胎總RNA，成功通過RT-PCR擴(kuò)增出band3基因片段，將擴(kuò)增的band3基因片段通過T4 DNA連接酶與載體PBSK質(zhì)粒進(jìn)行定向重組，得到PBSK-band3重組質(zhì)粒，經(jīng)過雙酶切以及序列測定確定PBSK-band3重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，并在此基礎(chǔ)上以PBSK-band3重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行T7體外轉(zhuǎn)錄，得到了片段為200 bp～500 bp的地高辛標(biāo)記的band3反義mRNA探針，并進(jìn)行斑馬魚全胚胎原位雜交技術(shù)觀察band3反義mRNA探針在Tuebingen野生型斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)情況。

band3基因表達(dá)的蛋白是紅細(xì)胞膜上主要的蛋白，由3個(gè)亞基組成。是紅細(xì)胞膜陰離子通道蛋白，也是Ser/Thr激酶的主要底物。本研究發(fā)現(xiàn)，band3基因在腎臟α-閏細(xì)胞和在心肌細(xì)胞中有所表達(dá)，說明band3基因與紅系造血有關(guān)，其作用可能是助于紅細(xì)胞提高二氧化碳的運(yùn)輸和維持形狀。在某些導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞的疾病中，如地中海貧血、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥等[11-12]。Band3蛋白發(fā)生磷酸化的結(jié)構(gòu)變化，破壞整個(gè)紅細(xì)胞膜的蛋白結(jié)構(gòu)，影響紅細(xì)胞的脆性和變形能力，從而發(fā)生一系列病理反應(yīng)。今后可以進(jìn)一步研究band3的表達(dá)對紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的影響。

圖3　PBSK-band3重組質(zhì)粒測序Fig.3　PBSK-band3 recombinant plasmid sequencing

圖4　PBSK-band3質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果Fig.4　Results of double enzyme digestion of PBSK-band3 plasmid

注：1、2為反義band3 mRNA圖5　地高辛標(biāo)記的反義band3 mRNAFig.5　Digoxigenin-labeled antisense band3 mRNA

注：藍(lán)色箭頭所示ICM，紅色箭頭所示AGM圖6　band3基因在野生型Tuebingen斑馬魚全胚胎中的表達(dá)Fig.6　Expression of band3 gene in wild-type Tüebingen zebrafish embryo

4參考文獻(xiàn)

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(2016-05-03收稿，2016-06-26修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(31260284； 31360285)； 貴州省科技基礎(chǔ)條件平臺項(xiàng)目[(2009)4005]； 貴州省優(yōu)秀科技省長專項(xiàng)基金(S2008-4)

[中圖分類號]R321-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)07-0760-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.004

Expression Pattern ofBand3 during Zebrafish Early Development

TUO Yuanyuan1, SHANG Lujun2, XIA Haixiong2, HE Zhixu1,3, SHU Liping2,3,4

(1.DepartmentofPediatrics,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China;2.DepartmentofImmunology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.LaboratoryAnimalCenter,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.TissueEngineeringandStemCellResearchCenter,GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: The antisense mRNA probe of band3 gene was adopted to conduct Zebrafish whole embryos mount in situ hybridization to detect the expression of band3 gene in wild-type Tüebingen zebrafish embryonic development. Method: Zebrafish embryo total RNA was extracted by Trizol, specific primers was designed and the cDNA coding region fragment band3 was amplified by RT-PCR. The recombinant PBSK/band3 plasmids was constructed by recombination technique and linearized with BamH I enzyme digestion. T7 RNA polymerase was adopted to synthesize antisense band3 RNA probes labeled by digoxigenin. Zebrafish whole embryos mount in situ hybridization was adopted to detect band3 gene expression in early zebrafish embryos. Results: The band3 gene fragments were cloned and PBSK/band3 recombinant plasmid was constructed successfully. The digoxigenin-labeled antisense band3 probe was obtained in vitro transcription. After mount in situ hybridization, it was observed that band3 gene was highly expressed in the middle cell population (ICM) and the renal region (AGM) of the aorta gonad in the early embryonic development of zebrafish. Conclusion: In this study, we prepare the antisense mRNA band3 probe labeled with digoxigenin and detect the expression of band3 gene in zebrafish embryos.

[Key words]zebrafish; embryo; band3; whole embryo mount in situ hybridization; probe

**通信作者 E-mail:gyslp-456@163.com; hzx@gmc.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-07-17網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.052.html