宋　錦, 姬牧遠(yuǎn), 吳西軍, 周艷華, 舒莉萍1，，4*** , 何志旭1，，3***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 干細(xì)胞與組織工程實(shí)驗(yàn)中心， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 兒科學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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p21基因在野生型斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)*

宋錦1，2**, 姬牧遠(yuǎn)2,3, 吳西軍2, 周艷華2, 舒莉萍1，2，4***, 何志旭1，2，3***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 干細(xì)胞與組織工程實(shí)驗(yàn)中心， 貴州 貴陽(yáng)550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 兒科學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 探究p21基因在斑馬魚(yú)早期發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)。方法: Trizol法提取野生型斑馬魚(yú)胚胎總RNA，RT-PCR法擴(kuò)增p21基因片段，與pCS2+載體重組構(gòu)建p21-pCS2+重組質(zhì)粒，以T3 RNA 聚合酶制備地高辛標(biāo)記的反義mRNA 探針，通過(guò)斑馬魚(yú)全胚胎原位雜交檢測(cè)p21 基因在野生型斑馬魚(yú)胚胎早期發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)。結(jié)果： 成功構(gòu)建了p21-pCS2+重組質(zhì)粒，并制備反義mRNA 探針；原位雜交結(jié)果顯示野生型斑馬魚(yú)0.5～18 hpf的胚胎均未發(fā)現(xiàn)p21 基因陽(yáng)性雜交信號(hào)，24～36 hpf 胚胎可在脊索部位觀察到陽(yáng)性信號(hào)，48～72 hpf 胚胎可在頭部胸腺附近觀察到陽(yáng)性信號(hào)，表達(dá)量均較低。結(jié)論： 成功制備了p21-pCS2+重組質(zhì)粒及斑馬魚(yú)p21 基因反義mRNA 探針，p21 基因在野生型斑馬魚(yú)胚胎不同發(fā)育時(shí)相中表達(dá)水平不同。

[關(guān)鍵詞]p21； 斑馬魚(yú)； 胚胎； 發(fā)育； 探針； 質(zhì)粒

p21 基因表達(dá)產(chǎn)物是細(xì)胞周期的一種抑制因子，是細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子CKI 中細(xì)胞因子誘導(dǎo)的蛋白/激酶相互作用蛋白Cip/Kip (cytokine-inducible protein/kinase inhibition protein,Cip/Kip) 家族的一員。當(dāng)在細(xì)胞接受到接觸抑制、DNA損傷、低氧及某些細(xì)胞因子等信號(hào)后產(chǎn)生P21基因表達(dá)產(chǎn)物，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、衰老及死亡過(guò)程，同時(shí)P21基因表達(dá)產(chǎn)物又與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，在細(xì)胞的生理、病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-3]。斑馬魚(yú)作為一種新興的模式生物，具有成魚(yú)體積小，適宜在較小空間里大量養(yǎng)殖,生命力強(qiáng),成熟周期短，繁殖能力強(qiáng),在體外受精發(fā)育,胚胎透明，便于在四維領(lǐng)域即其前后、上下、左右及時(shí)間上進(jìn)行觀察，可進(jìn)行高通量基因篩查，全基因組測(cè)序工作已完成等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)斑馬魚(yú)與哺乳動(dòng)物在分子途徑調(diào)控造血上高度保守，提供了幾乎與哺乳動(dòng)物和其他高級(jí)脊椎動(dòng)物一致的造血系統(tǒng)[4]。因此，利用斑馬魚(yú)作為模式生物來(lái)研究造血系統(tǒng)功能和疾病有著廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚(yú)為對(duì)象，構(gòu)建p21-pCS2+重組質(zhì)粒，制備p21反義mRNA探針，以全胚胎原位雜交法觀察斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中p21的表達(dá)情況，為下一步以斑馬魚(yú)作為模型研究p21奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

Tuebingen品系斑馬魚(yú)參照Westerfield[5]方法養(yǎng)殖在28.5℃的循環(huán)水系統(tǒng)中。根據(jù)Kimmel等[6]文獻(xiàn)中提供的斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育圖譜，區(qū)分其發(fā)育階段，收集時(shí)相為受精后0.75 h(0.75 hours post-fertilization，hpf)、3.7 hpf、6 hpf、12 hpf、18 hpf、24 hpf、30 hpf、36 hpf、48 hpf以及72 hpf。

1.2方法

1.2.1獲取p21 cDNA收集野生型斑馬魚(yú)胚胎，每個(gè)時(shí)相10 枚，用Trizol方法提取總RNA，使用Transgene公司TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取p21 cDNA，操作按說(shuō)明書(shū)。

1.2.2體外克隆p21根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)提供的斑馬魚(yú)p21基因全長(zhǎng)cDNA，設(shè)計(jì)引物序列p21-F，5′-CC ATCGAT GG CAGCTCTTGCAGAAGCTC-3′；p21-R，5′-GCTCTAGACTGGCCGG ATTTGCGCGG-3′；引物序列包含ClaⅠ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)。利用KOD-plus擴(kuò)增p21基因，為保證PCR產(chǎn)物的特異性，將上述體系以降落PCR法完成體外擴(kuò)增。PCR程序如下：94 ℃ 8 min，94 ℃ 40 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，以后每2個(gè)循環(huán)降低退火溫度1 ℃至退火溫度降至60 ℃，94 ℃ 40 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s(20個(gè)循環(huán))，72 ℃ 10 min。

1.2.3構(gòu)建p21-pCS2+重組質(zhì)粒將pCS2+質(zhì)粒及p21 基因的PCR 產(chǎn)物分別用ClaⅠ、XbaⅠ雙酶切，酶切后進(jìn)行電泳分析，回收目的條帶，將回收的經(jīng)酶切的pCS2+質(zhì)粒及p21 基因PCR 產(chǎn)物進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入EcoliDH5α 感受態(tài)菌，通過(guò)AMP 抗性篩選，挑選陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增后用Axygen 質(zhì)粒小抽試劑盒抽提p21-pCS2+重組質(zhì)粒。

1.2.4p21-pCS2+重組質(zhì)粒鑒定 以ClaⅠ及XbaⅠ雙酶切p21-pCS2+重組質(zhì)粒，通過(guò)瓊脂糖電泳判斷酶切產(chǎn)物大小，鑒定是否有插入序列DNA 及pCS2+質(zhì)粒DNA。并將p21-pCS2+重組質(zhì)粒委托北京諾賽基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5制備p21 基因反義mRNA 探針將p21-pCS2+重組質(zhì)粒用ClaⅠ單酶切進(jìn)行質(zhì)粒DNA 線性化，將線性化p21-pCS2+重組質(zhì)粒加入地高辛標(biāo)記的寡核苷酸，利用T3RNA 聚合酶完成體外轉(zhuǎn)錄，得到地高辛標(biāo)記的p21 基因反義mRNA 探針，置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6斑馬魚(yú)p21全胚胎原位雜交分別收集0.75～72 hpf時(shí)相的野生型斑馬魚(yú)胚胎，去除卵膜，4%多聚甲醛(PFA)固定24 h，用1×PBST 洗3次，然后依次用25%甲醇(PBS)、50%甲醇(PBS)、75%甲醇(PBS)和100%甲醇洗滌，-20 ℃保存過(guò)夜。體視顯微鏡下挑選已脫水的完整胚胎，每個(gè)時(shí)相挑選20～30 枚，依次用75 %甲醇(PBST)、50%甲醇(PBST)、25%甲醇(PBST) 溶液洗滌1次。24 hpf之后的斑馬魚(yú)胚胎需用蛋白酶K 處理，以利于探針滲透。將胚胎移入68 ℃雜交爐，加入預(yù)熱的預(yù)雜交液HYB(-)， 15 min。吸出HYB(-)，加入HYB(+)，68℃ 1 h；再加入地高辛標(biāo)記的p21反義mRNA 探針，68 ℃過(guò)夜。在雜交爐中，用50%甲酰胺(2×SSCT)1mL洗滌兩次，每次68 ℃ 30 min。再用2×SSCT 1 mL洗滌1次，68 ℃ 15 min。最后用0.2×SSCT 1 mL洗滌兩次，每次68 ℃ 30 min。將胚胎移至十二孔板中，用MABT 2.5 mL洗3次，每次室溫輕搖5 min。加入阻滯液2.5 mL于室溫下輕搖1 h。加入抗地高辛抗體至終濃度為1∶5 000，4 ℃輕搖過(guò)夜。吸去抗體，用阻滯液 lml洗滌1次，室溫輕搖30 min，再用MABT 2 mL洗滌兩次，室溫輕搖1 h及30 min，用染色緩沖液洗滌3次。加入NBT/BCIP染液染色，并在體視顯微鏡下觀察，直至染色成功。將胚胎用1×PBST洗滌后，用4%的多聚甲醛固定，4 ℃保存，在體視顯微鏡(Nikon-SMZ150)下拍照。

2結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒p21-pCS2+及反義p21 基因反義mRNA 探針

PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析顯示500 bp 附近可見(jiàn)一特異擴(kuò)增帶，大小與預(yù)期525 bp 結(jié)果相符(圖1)；重組質(zhì)粒p21-pCS2+電泳結(jié)果顯示，在4 000 bp 附近可見(jiàn)兩條條帶，525 bp 附近可見(jiàn)1條條帶(圖2)，提示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。p21 基因反義mRNA 探針電泳結(jié)果顯示，在500 bp位置有明顯條帶，重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果通過(guò)Genbank 比對(duì)顯示與所需p21 基因片段完全一致,提示p21 基因反義mRNA 探針制備成功(圖3、圖4)。2.2p21 基因在野生型斑馬魚(yú)全胚胎原位雜交結(jié)果

0.75～18 hpf 胚胎未見(jiàn)p21 基因陽(yáng)性雜交信號(hào)(圖5 A-F)，24～36 hpf 胚胎部分脊索可觀察到p21 基因陽(yáng)性雜交信號(hào)(圖5 G-I紅色箭頭所示)，但表達(dá)量并不高；48～72 hpf 胚胎在頭部可見(jiàn)陽(yáng)性信號(hào)(圖5 J-K綠色箭頭所示)，兩側(cè)對(duì)稱(chēng)出現(xiàn)。0.75～72 hpf在斑馬魚(yú)胚胎造血區(qū)如ICM 區(qū)、AGM 區(qū)未觀察到陽(yáng)性雜交信號(hào)，提示野生型斑馬魚(yú)造血系統(tǒng)無(wú)p21 基因表達(dá)或p21 基因表達(dá)極低(圖5)。

注：1為DNA marker Ⅲ，2為PCR產(chǎn)物，3為GAPDH，4為空白對(duì)照?qǐng)D1　p21 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.1　Electrophoresis of PCR products of p21

注：1為DNA marker Ⅲ，2為Enzyme digested p21-pCS2+，3為L(zhǎng)inearity p21-pCS2+,4為L(zhǎng)inearity plasmid pCS2+，5為空白對(duì)照?qǐng)D2　p21-pCS2+限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定Fig.2　The restriction enzymes digest p21-pCS2+with ClaⅠand XbaⅠ

注：1為DNA marker Ⅳ，2和3為反義p21 mRNA探針，4為空白對(duì)照?qǐng)D3　p21 基因反義mRNA 探針電泳Fig.3　Electrophoresis of the anti-sense p21 mRNA probe

3討論

p21基因最初是通過(guò)酵母雙雜交及消減雜交等方法得到，主要參與DNA損傷的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)[7-8]。Harpeer等在研究CDK2的調(diào)節(jié)蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn),p21作為CDK2及其他CDK的抑制物，在細(xì)胞分裂過(guò)程中起著關(guān)卡作用[9]。Vogelstein等在尋找受p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因中發(fā)現(xiàn)了p21基因，將其稱(chēng)為WAFl(wild-type p53-activated fragment1)，將其導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞時(shí),可發(fā)現(xiàn)其與p53有同樣的抑瘤效應(yīng)[10]。目前，有關(guān)p21基因的結(jié)構(gòu)功能的認(rèn)識(shí)逐漸增多，許多研究表明其與細(xì)胞終末分化、損傷、衰老有著重要的功能意義，并參與癌癥的發(fā)生[11-13]。因此對(duì)p21基因相關(guān)功能的研究可能成為治療癌癥的新靶點(diǎn)。

p21基因最核心的功能是其參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的功能，可影響細(xì)胞的自我更新、分裂、分化及凋亡等。當(dāng)DNA損傷時(shí)，一系列蛋白激酶被激活、核苷酸的耗竭、氧供不足和過(guò)剩等可激活p53，p21基因編碼區(qū)上游2.4 kb和約8 kb處有2個(gè)p53共有的結(jié)合區(qū)，因而p53基因激活會(huì)導(dǎo)致其靶基因p21基因的迅速轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄出的p21蛋白可與CDK2 等因子結(jié)合，抑制其活性,使受到損傷的細(xì)胞停滯于G1期,不能進(jìn)一步進(jìn)行DNA復(fù)制和有絲分裂,從而使受損的細(xì)胞有充分的時(shí)間修復(fù), 不能修復(fù)的則發(fā)生凋亡[10，14]。研究發(fā)現(xiàn)，在血清供給量不足、接觸性抑制和衰老等條件下，通過(guò)腫瘤壞死因子、組織型纖溶酶原激活劑等因素的作用，p21基因可以快速發(fā)生反應(yīng)，使受損的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，在正常組織細(xì)胞的發(fā)育、分化中非依賴(lài)p53途徑的p21基因的調(diào)節(jié)同樣存在[15]。p21基因可以與增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen ，PCNA)相互作用，在S期發(fā)生DNA損傷，通過(guò)p21 C端競(jìng)爭(zhēng)性抑制DNA聚合酶和PCNA的結(jié)合，阻斷PCNA活化DNA聚合酶的活性從而抑制DNA的合成，使細(xì)胞周期停滯[16]。

圖4　p21-pCS2+重組質(zhì)粒測(cè)序Fig.4　DNA Sequence of the recombinant plasmid of p21-pCS2+

注：紅色箭頭為脊索，綠色箭頭為胸腺圖5　p21基因在野生型斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)Fig.5　Expression of p21 gene in wild-type zebrafish embryos

目前斑馬魚(yú)作為一種模式生物已廣泛應(yīng)用于各種疾病的研究。對(duì)致癌化合物引起的斑馬魚(yú)腫瘤的研究顯示，其在基因組學(xué)及組織病理等方面與人類(lèi)腫瘤高度相似[17-18]。2003年，Langenau等[19]創(chuàng)建了首個(gè)斑馬魚(yú)白血病模型，并且將該白血病模型斑馬魚(yú)的血細(xì)胞轉(zhuǎn)入亞致死量射線照射過(guò)的野生型斑馬魚(yú)，同樣可以引起白血病癥狀，這進(jìn)一步引起了通過(guò)斑馬魚(yú)來(lái)研究造血系統(tǒng)疾病的熱潮。p21基因是一個(gè)高度保守的基因，在氨基酸水平上人的p21基因與斑馬魚(yú)有87%的同源性。因此本研究選擇斑馬魚(yú)為模式生物，有利于對(duì)p21基因的功能的研究，也是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道p21基因在野生斑馬魚(yú)中的表達(dá)情況。

在本研究中，通過(guò)對(duì)野生型斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行全胚胎原位雜交，在胚胎發(fā)育早期(0.75～18 hpf)未觀察到p21基因表達(dá)，p21基因?yàn)榧?xì)胞周期中與G1/S檢查點(diǎn)相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞增殖的機(jī)制相關(guān)；當(dāng)有錯(cuò)誤的DNA復(fù)制時(shí)，p21基因表達(dá)增加，限制細(xì)胞周期的進(jìn)程，使其進(jìn)行DNA修復(fù)后再繼續(xù)分裂。故對(duì)此推測(cè)在細(xì)胞增殖受阻的部位p21基因呈高表達(dá)，而在細(xì)胞分裂、分化旺盛的部位其表達(dá)降低，早期斑馬魚(yú)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育旺盛，細(xì)胞大量分化，所以p21基因表達(dá)量低，通過(guò)原位雜交方法不能觀測(cè)到其表達(dá)，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。24～36 hpf胚胎可在脊椎部位觀察到陽(yáng)性信號(hào)，表明p21基因與斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中可能與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)。48～72 hpf胚胎可在頭部觀察到陽(yáng)性信號(hào)，兩側(cè)對(duì)稱(chēng)出現(xiàn)，考慮該部位為胸腺。下一步可通過(guò)胸腺發(fā)育相關(guān)的基因進(jìn)行進(jìn)一步認(rèn)證p21是否在斑馬魚(yú)胸腺內(nèi)表達(dá)，利用斑馬魚(yú)優(yōu)勢(shì)模式生物，可能揭示T細(xì)胞的發(fā)生和分化與p21的關(guān)系。

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(2016-05-10收稿，2016-06-21修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 趙毅

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30960412)； 貴州省科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目[(2009)4005]； 貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專(zhuān)項(xiàng)資金(S2008-4)

[中圖分類(lèi)號(hào)]R394.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)07-0765-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.005

The Expression ofp21 in Development of Wild Type Zebrafish Embryo

SONG Jin1,2, JI Muyuan2,3, WU Xijun2， ZHOU Yanhua2, SHU Liping1,2,4, HE Zhixu1,2,3

(1.DepartmentofImmunology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.TheCenterofStemCellandTissueEngineeringResearch,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofPaediatrics,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.LaboratoryAnimalCenter,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the expression of p21 in zebrafish. Methods: Extract 0.75 hpf～120 hpf wild-type Zebrafish embryos in multiple phase and total RNA by Trizol, amplificating p21 gene by RT-PCR, and constructing p21-pCS2+plasmid. Preparing antisense mRNA probe with T3 RNA polymerase, using zebrafish whole-mount in situ hybridization to examine the p21 expression pattern in early embryo development. Results: Successfully constructed p21-pCS2+plasmid, preparing antisense mRNA probe; within situ hybridization, there is no expression of p21 in wild-type zebrafish at 0.5 hpf～18 hpf; positive signal in notochord was found in 24 hpf～36 hpf of the wild-type Zebrafish embryos, and positive signal could be found near head and thymus, but indicating low expression. Conclusion: In this research, it has been successfully constructed p21-pCS2+plasmid, antisense mRNA probe preparation, and have a preliminary observation in the expression of p21 gene in Zebrafish embryos in different periods.

[Key words]p21； zebrafish；embryo；development; probe; plasmid

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)碩士研究生

***通信作者 E-mail:gyslp456@gmc.edu.cn； hzx@gmc.edu.cn

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