宋　錦， 李　莉， 尚魯俊， 吳西軍， 周艷華 ， 何志旭***， 舒莉萍，4***

(1.貴州醫(yī)科大學 免疫學教研室， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫(yī)科大學 干細胞與組織工程實驗中心， 貴州 貴陽　550004； 3.貴州醫(yī)科大學 兒科學教研室， 貴州 貴陽　550004； 4.貴州醫(yī)科大學 實驗動物中心, 貴州 貴陽　550004)

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·專題研究·

新疾病模式生物斑馬魚G6PD酶活性的動態(tài)研究*

宋錦1，2**， 李莉2，3， 尚魯俊1，2， 吳西軍2， 周艷華2， 何志旭2，3***， 舒莉萍1，2，4***

(1.貴州醫(yī)科大學 免疫學教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學 干細胞與組織工程實驗中心， 貴州 貴陽550004； 3.貴州醫(yī)科大學 兒科學教研室， 貴州 貴陽550004； 4.貴州醫(yī)科大學 實驗動物中心, 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 觀察不同發(fā)育時期的斑馬魚胚胎、成年斑馬魚不同組織的G6PD酶活性及g6pd mRNA的表達。方法: 收集受精后24 h(24 hpf)、48 hpf、受精后5 d(5 dpf)及15 dpf的野生型斑馬魚胚胎，同時收集成年斑馬魚的腦、肌肉、鰓、皮膚、眼睛及腸等組織，運用改良G6PD定量比值法和RT-PCR法檢測上述胚胎或組織的G6PD酶活性及g6pd mRNA表達水平。結(jié)果: G6PD酶活性、g6pd mRNA表達水平在24 hpf、48 hpf、5 dpf及15 dpf比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在成年斑馬魚的腦、肌肉、鰓、皮膚、眼睛及腸等不同部位組織比較，差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論: 野生斑馬魚G6PD酶活性、g6pd mRNA表達水平不受胚胎發(fā)育時期和組織部位的影響。

[關(guān)鍵詞]斑馬魚； 胚胎； 葡萄糖6磷酸脫氫酶； 酶活性； mRNA

葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥屬于X染色體連鎖不完全顯性遺傳性疾病，據(jù)統(tǒng)計目前全球約有4億人受此病的困擾，中國是主要的發(fā)病國家之一[1]。在中國，G6PD缺乏癥的流行病學特點呈“南高北低”趨勢，主要分布在長江以南地區(qū)，以廣東、廣西、貴州、四川、云南、海南等省為高[1-2]。G6PD缺乏癥是由于g6pd基因發(fā)生突變引起，且絕大多數(shù)為點突變[3]。早有文獻報道G6PD缺乏癥的小鼠疾病模型，但篩選出的G6PD缺乏純合子小鼠在胚胎期就會發(fā)生死亡，當使用氧化劑對雜合子小鼠處理后其溶血現(xiàn)象不明顯，這對G6PD缺乏癥的后期研究有一定的局限性[4]。斑馬魚作為近年來新興的模式生物，具有養(yǎng)殖方便、產(chǎn)卵量大、胚胎透明、養(yǎng)殖周期較短以及與人類基因高度保守等優(yōu)勢[5]，推測若利用斑馬魚建立G6PD缺乏癥模型，將更有利于G6PD缺乏癥研究，但需了解斑馬魚G6PD酶活性情況及正常值范圍，以評估G6PD缺乏斑馬魚模型中G6PD情況。本研究在常規(guī)的改良G6PD定量比值法的基礎(chǔ)上，根據(jù)斑馬魚的特點進行優(yōu)化，嘗試建立一種斑馬魚G6PD酶活性的檢測方法，以期了解不同發(fā)育時期斑馬魚胚胎、成體斑馬魚不同組織中G6PD酶活性的含量，并用RT-PCR法了解g6pdmRNA表達情況，為進一步利用斑馬魚研究G6PD缺乏癥奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗動物

實驗所需Tuebingen品系野生型斑馬魚參照文獻[6]方法養(yǎng)殖在28 ℃循環(huán)水系統(tǒng)中。根據(jù)文獻[7]的斑馬魚生長發(fā)育圖譜區(qū)分其發(fā)育階段，收集受精后24 h(24 hours post-fertilization，24 hpf)、48 hpf、受精后5天(5 days post-fertilization，5 dpf)、15 dpf的野生型斑馬魚。

1.2樣本制備

1.2.1斑馬魚胚胎樣品分別收集不同時相野生型斑馬魚20～40枚胚胎，剝除胚胎表面的胎膜，1×PBS中清洗3遍，冰上研磨胚胎，加入500 μL的0.25%胰酶，在37 ℃溫箱消化20～30 min，加入800 μL的胎牛血清終止消化，瞬時離心，留下250 μL的下層細胞液體，并將細胞液體轉(zhuǎn)移至Becton Dickinson falcon 40 μm (BD)尼龍濾網(wǎng)(冰上操作)，4 ℃，800 r/min，離心5 min后，棄上清。加入0.9×FBS/PBS 200 μL，將細胞懸液混勻，加入BD過濾膜過濾后，4 ℃，800 r/min，離心5 min，棄上清液。加入0.9×FBS/PBS 15 μL，制成單細胞懸液，再加入雙蒸水(ddH2O) 200 μL，制備細胞溶液。

1.2.2斑馬魚成魚樣本(1)全血樣品制備：取斑馬魚成魚1尾，禁食3 d后于尾部動靜脈叢處切尾取血，吸取血液加入EDTA-K2抗凝劑的抗凝管中；收集抗凝全血15 μL，加入ddH2O 200 μL，制備溶血液。(2)不同組織樣品制備：在冰上解剖成年斑馬魚，取出腦、肌肉、鰓、皮膚、眼睛、腸，取出組織后1×PBS清洗3遍，分別置于無菌清潔載玻片剁碎(冰上操作)，用上述方法制成單細胞懸液，加入ddH2O 200 μL，制備成細胞溶液。

1.3斑馬魚g6pdcDNA

收集不同時相斑馬魚胚胎及斑馬魚各組織，用Trizol法提取斑馬魚總RNA，使用Thermo公司的TransScript First-Strand cDNA synthesis Supermix試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA(按說明書進行操作)。

1.4改良G6PD比值法測定斑馬魚G6PD 酶活性

使用改良G6PD測定試劑盒(定量比值法，廣州米基醫(yī)療器械有限公司)測定G6PD酶活性，對試劑盒使用體系再次改良后進行檢測，檢測體系為：G6PD管， G6PD 6 μL、NBT 8 μL、PMS 4 μL、ddH2O 33 μL、溶血液 50 μL；6PGD 管，6PGD 6 μL、NBT 8 μL、PMS 4 μL、ddH2O 33 μL、溶血液50 μL。利用日本島津紫外分光光度儀UV-2401在650 nm條件下分別檢測G6PD管及6PGD管的吸光度(OD)值，計算G6PD/6PGD比值，判斷G6PD活性。

1.5g6pdmRNA表達水平

采用RT-PCR法半定量法，根據(jù)斑馬魚cDNA文庫中g(shù)6pd基因組序列，參照Pubmed-Nucleotide 中斑馬魚g6pd基因的CDS序列設(shè)計引物，并在引物前端加入酶切位點，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，正向引物為5′- GGATCCATGATGGGCAGTCGAGCGAG-3′，反向引物為5′-GAATTC AGTGTCAAACACACCTAAGT-3′。以g6pdcDNA作為模板，使用高保真DNA聚合酶KOD plus進行PCR擴增，PCR反應程序如下：94 ℃ 8 min，94 ℃ 40 s、66 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，目的條帶為1 527 bp，利用灰度軟件對電泳結(jié)果進行分析，得出相應的g6pd半定量值，對灰度分析值進行統(tǒng)計學分析。

1.6統(tǒng)計學方法

對斑馬魚不同組織、不同時相胚胎的G6PD酶活性結(jié)果，g6pdmRNA表達水平電泳條帶灰度值采用EXCEL軟件對數(shù)據(jù)進行雙錄核實，建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS 19.0軟件對G6PD酶活性結(jié)果采用單因素方差分析。對斑馬魚各組織、不同時相胚胎g6pdmRNA表達水平電泳條帶灰度值采用Wilcoxon符號秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1G6PD酶活性

對24 hpf、48 hpf、5 dpf、15 dpf 時相斑馬魚胚胎，成年斑馬魚腦、鰓、肌肉、皮膚、眼及腸組織(圖1)利用改良G6PD定量比值法對G6PD酶活性進行檢測，結(jié)果顯示不同發(fā)育時相斑馬魚胚胎，成年斑馬魚不同組織G6PD/6PGD比值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2，提示不同發(fā)育時相胚胎及不同組織中G6PD酶活性處于同一水平。

2.2g6pdmRNA表達水平

本研究對野生型不同時相斑馬魚胚胎及成年斑馬魚不同組織中g(shù)6pdmRNA進行1%瓊脂糖電泳及灰度分析。結(jié)果顯示，不同時相斑馬魚胚胎(圖3),成年斑馬魚不同組織(見圖4)中的g6pdmRNA表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，進一步證實，斑馬魚不同發(fā)育時期胚胎就成年斑馬魚不同組織中G6PD酶活性無明顯差異。

圖1　成年斑馬魚的不同組織Fig.1　The different tissues of adult zebrafish

圖2　不同時相斑馬魚胚胎及成年斑馬魚不同組織G6PD/6PDG比值Fig.2　G6PD/6PGD in different phases and tissues of zebrafish embryos

注：A中1為DNA MakerⅢ，2～5分別為24、48 hpf和5、15 dpf， 6為對照圖3　斑馬魚不同發(fā)育時期胚胎中g(shù)6pd mRNA表達Fig.3　The expression of g6pd mRNA in different tissues of zebrafish

注：A中1為DNA MakerⅢ， 2為血， 3為腦， 4為皮膚，5為鰓， 6為腸，7為肌肉，8為眼，9為對照圖4　成年斑馬魚不同組織中g(shù)6pd mRNA表達Fig.4　The expression of g6pd mRNA in different tissues of zebrafish

3討論

G6PD是參與紅細胞酵解磷酸戊糖氧化途徑的起始限速酶，能催化生成重要的還原性物質(zhì)還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)。NADPH是體內(nèi)許多合成代謝的供氫體，是重要抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽(GSH)維持還原狀態(tài)所必需的輔酶。還原型GSH可以保護細胞以及細胞膜免受氧化劑的損害[8]。當機體G6PD酶活性缺乏時，機體還原型GSH抗氧化效果減弱，紅細胞膜無法抵抗氧化攻擊，受累紅細胞因此失去變形能力，容易在血流的沖擊及毛細血管的擠壓作用下發(fā)生破溶，進而發(fā)生急性溶血[9]。已有的G6PD缺乏小鼠疾病模型中，由于G6PD缺乏純合子小鼠在胚胎期就發(fā)生死亡，且雜合子小鼠對氧化劑反應差，致使對G6PD缺乏癥的研究存在一定的局限性[4]。此外，由于缺乏合適的動物模型對抗瘧疾藥物進行篩選，導致抗瘧疾藥的新藥開發(fā)出現(xiàn)瓶頸[10]，因此對G6PD缺乏癥的研究仍有很多問題亟待解決。

斑馬魚是近年來新興的模式生物，其作為實驗動物具有小鼠等其他模式生物所無法比擬的優(yōu)點，例如：體外受精，產(chǎn)卵量大，便于行高通量基因篩查及藥物篩選；其胚胎透明，便于觀察；成魚體型較小，生長發(fā)育快，且易于飼養(yǎng)；斑馬魚基因與人類基因保守度約85%；斑馬魚在進化過程中，雖和人類相距較遠，但是造血發(fā)育是高度保守的[5，11-12]。目前為止已利用斑馬魚成功建立起多種造血系統(tǒng)疾病的模型[13-14]。由于斑馬魚體型小，本研究根據(jù)改良的G6PD定量比值法試劑盒說明書將步驟及體系進行優(yōu)化后，對野生型斑馬魚的不同組織，不同時相胚胎G6PD/6PGD進行檢測，通過G6PD/6PGD比值反應斑馬魚各個組織及不同時相的G6PD酶活性情況。本研究中，在選擇成年野生型斑馬魚的組織時，盡量將所有組織解剖后制備成細胞懸液，但是部分組織(比如心臟、脾臟、膽囊等)解剖后不易獲得或者體積過小難以獲得足夠的樣本，本研究挑選出腦、眼睛、皮膚、肌肉、腸、魚鰓六組組織作為實驗對象。斑馬魚不同組織與血液G6PD/6PGD比值差異無統(tǒng)計學意義，提示斑馬魚組織和血液G6PD酶活性處于同一水平。由于斑馬體型小，血量小，在后期利用斑馬魚對G6PD缺乏癥進行研究時，可利用斑馬魚組織的G6PD酶活性情況反映斑馬魚血液G6PD酶活性情況，可大大降低操作復雜性。同時為觀察G6PD酶活性是否隨斑馬魚發(fā)育變化而變化，本研究挑選24 hpf、48 hpf、5 dpf以及15 dpf 的胚胎作為對象，檢測結(jié)果提示不同時相斑馬魚胚胎G6PD/6PGD比值處于同一水平，考慮斑馬魚發(fā)育過程中G6PD酶活性波動較小。另外，本研究還運用RT-PCR半定量法對斑馬魚不同組織及不同時相胚胎中g(shù)6pdmRNA表達情況進行半定量分析，觀察斑馬魚不同組織及不同時相胚胎g6pd基因mRNA表達情況與G6PD 酶活性檢測結(jié)果是否一致。對1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進行灰度分析后，統(tǒng)計學分析顯示斑馬魚各個組織及不同時相胚胎中g(shù)6pd的轉(zhuǎn)錄水平均值差異無統(tǒng)計學意義，與斑馬魚G6PD 酶活性檢測結(jié)果一致。

人類G6PD表達與斑馬魚相比有所不同，人類肌肉組織中G6PD表達極低，與血液中G6PD酶活性相差很大[15]。而經(jīng)本研究對斑馬魚不同組織及不同發(fā)育時相胚胎進行G6PD酶活性及g6pdmRNA半定量分析，發(fā)現(xiàn)斑馬魚中不同組織及不同時相胚胎之間G6PD酶活性差異無統(tǒng)計學意義。因此推測，由于g6pd基因是一類管家基因，所以經(jīng)改良G6PD定量比值法檢測及RT-PCR半定量分析結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學分析后提示其各組之間差異無統(tǒng)計學意義。本實驗反應出斑馬魚G6PD 酶活性的趨勢，以及不同組織及不同發(fā)育時期斑馬魚G6PD酶活性無明顯差異，為進一步對利用斑馬魚建立G6PD缺乏斑馬魚模型及對G6PD缺乏癥進行研究奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究建立檢測斑馬魚G6PD酶活性的技術(shù)，以及檢測出斑馬魚不同組織及不同時相斑馬魚胚胎G6PD酶活性的標準值。并通過RT-PCR法對不同組織及不同時相斑馬魚胚胎中g(shù)6pdmRNA進行半定量分析，進一步提示斑馬魚不同組織及不同時相斑馬魚胚胎中G6PD酶活性無明顯差異，為下一步構(gòu)建G6PD缺乏斑馬魚模型及研究G6PD缺乏癥奠定基礎(chǔ)。

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(2016-04-23收稿，2016-06-11修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

*[基金項目]國家自然科學基金項目資助(31360285)

[中圖分類號]R392.9

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)07-0750-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.002

Dynamic Research G6PD Enzyme Activity of New Disease Patterns Zebrafish

SONG Jin1,2, LI Li2,3, SHANG Lujun1,2, WU Xijun2, ZHOU Yanhua2, HE Zhixu1,2,3, SHU Liping1,2,4

(1.DepartmentofImmunology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.TheCenterofStemCellandTissueEngineeringResearch,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofPaediatrics,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.ExperimentalAnimalCenter,GuizhouMedicalUniversity,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe G6PD enzyme activity and G6PD mRNA expression in different tissues of zebrafish embryos and adult zebrafish at different developmental stages. Method: After fertilization, 24 hpf (24 hour post-fertilization), 48 hpf, 5 dpf (5 day post-fertilization) and 15dpf wild type zebrafish embryos were collected, and the brain, muscle, gill, skin, eyes and intestine of adult zebrafish were collected simultaneously. The modified G6PD quantitative ratio assay and RT-PCR were adopted to detect G6PD activity and mRNA expression levels in zebrafish embryos and tissues. Result: There was no statistically significant difference in G6PD activity and mRNA expression levels between 24 hpf, 48 hpf, 5 dpf and 15 dpf(P>0.05). There was also no statistically significant difference in G6PD activity and mRNA expression levels between brain, muscle, gill, skin, eyes and intestine(P>0.05).Conclusion: The G6PD activity and mRNA expression level of wild zebrafish is not affected by embryonic development period and tissue site.

[Key words]zebrafish; embryo； glucose-6-phosphate dehydrogenase; enzymatic activity; mRNA

**貴州醫(yī)科大學2013級碩士研究生

***通信作者 E-mail:hzx@gmc.edu.cn； gyslp456@gmc.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-07-17網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.004.html