何越，施丹麗，秦駿，羅蒙

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·論著 基礎(chǔ)研究·

PEG-CAT改善門靜脈高壓癥全身高動力循環(huán)的實驗探索

何越1，施丹麗2，秦駿1，羅蒙3

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院 普通外科，上海 200011；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院 普通外科，上海 201999；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 普通外科，上海 200127）

［摘 要］目的 研究聚乙二醇過氧化氫酶（polyethylene glycol-catalase，PEG-CAT）對肝硬化門靜脈高壓癥大鼠臟器血流動力學(xué)的影響，并探明活性氧產(chǎn)物在肝硬化門靜脈高壓癥治療中的作用。方法 實驗分為正常大鼠（正常組，共6只）、CCl4誘導(dǎo)的肝硬化門靜脈高壓癥大鼠（門靜脈高壓組，共7只）以及PEG-CAT處理的門靜脈高壓癥大鼠（PEG-CAT組，共6只）。采用插管法測動脈及門靜脈壓力，彩色微球法檢測心出量及內(nèi)臟器官血流變化，過氧化氫檢測試劑盒檢測小腸及腸系膜過氧化氫含量變化，并用Western blotting測小腸及腸系膜血管形成標(biāo)志物VEGF、VEGFR2及CD31蛋白表達(dá)。結(jié)果 （1）門靜脈壓力：與正常組比，門靜脈高壓組和PEG-CAT組明顯升高（P＜0.05），但后兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；（2）臟器血流：與正常組比，除胰腺及結(jié)腸血流無明顯差別外（P＞0.05），實驗組其他各內(nèi)臟血流均顯著升高（P＜0.05），PEGCAT干預(yù)則能顯著降低上述各內(nèi)臟血流量；（3）過氧化氫含量：與正常組比，門靜脈高壓組小腸及腸系膜中過氧化氫含量顯著升高（P＜0.05），在PEG-CAT干預(yù)后其含量顯著降低（P＜0.05），但與正常組比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；（4）使用PEG-CAT降低組織過氧化氫含量后，VEGF、VEGFR2及CD31三種蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論 CCl4致肝硬化門靜脈高壓癥大鼠小腸及腸系膜過氧化氫含量增高，從而導(dǎo)致VEGF、VEGFR2及CD31蛋白表達(dá)增加及門靜脈血流阻力減少和血流量增加。PEG-CAT干預(yù)雖不能降低門靜脈壓力，但可顯著降低門靜脈血流量。這一實驗結(jié)果肯定了過氧化氫在肝硬化門靜脈高壓癥內(nèi)臟高血液動力狀態(tài)形成中的作用，并為以降低內(nèi)臟組織過氧化氫含量為宗旨的肝硬化門靜脈高壓癥臨床治療提供了初步實驗依據(jù)。

［關(guān)鍵詞］肝硬化；高血壓，門靜脈；過氧化氫；大鼠

肝硬化門靜脈高壓癥為多種慢性肝臟疾病病程的終末階段［1］，表現(xiàn)為肝內(nèi)肝臟結(jié)構(gòu)紊亂假小葉形成，肝竇受到壓迫致血液流通受阻［2］；肝外則為全身高動力循環(huán)、門靜脈血流流入增多從而導(dǎo)致壓力升高。慢性肝臟疾病患者體內(nèi)出現(xiàn)門靜脈高壓癥狀后，則極易出現(xiàn)胃底-食管靜脈曲張破裂出血、腹水等并發(fā)癥，嚴(yán)重危害患者生命安全及生活質(zhì)量［3］。因此減緩甚至逆轉(zhuǎn)門靜脈高壓癥的發(fā)展從而減少相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生一直是這一領(lǐng)域的研究重點。

許多研究表明，肝硬化門靜脈高壓癥機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平是增高的，通過使用NADPH抑制劑抑制活性氧的產(chǎn)生或直接使活性氧產(chǎn)物降解為無活性物質(zhì)可顯著降低門靜脈壓力［4-6］，證明過高的氧化應(yīng)激產(chǎn)物含量與門靜脈高壓癥的病理變化有關(guān)；但這些研究對于活性氧的定量標(biāo)準(zhǔn)值得商榷，且未能探明其潛在機(jī)制，使將這些研究結(jié)果應(yīng)用到臨床實際治療中的可能大大減少。在本實驗中，我們探索通過改善肝外高動力循環(huán)從而降低門靜脈壓力作為未來控制門靜脈高壓癥發(fā)生的可能性；同時，通過使用過氧化氫抑制劑—聚乙二醇過氧化氫酶（polyethylene glycol-catalase，PEG-CAT），進(jìn)一步闡明活性氧作用于門靜脈高壓癥全身高動力循環(huán)的潛在機(jī)制及作用靶點?，F(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 動物和試劑

體重為350～400 g雄性SD大鼠19只，購自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。過氧化氫抑制劑聚乙二醇過氧化氫酶（PEG-CAT），美國Sigma公司。兔抗VEGF多克隆抗體、兔抗VEGFR2多克隆抗體、兔抗CD31多克隆抗體以及GAPDH內(nèi)參抗體均購自美國Sant Cruz公司?？雇每贵w，美國Cell Signaling Technology公司。血溶血試劑（blood hemolysis reagent，BHR）由無水乙醇與10% Triton X-100溶液以1∶5的比例配置。堿性消化試劑（alkaline digestion reagent，ADR）由每112.22 g氫氧化鉀溶于2 L蒸餾水配制而成。酸化乙醇試劑（acidified ethanol reagent，AE）由37%濃度鹽酸與無水乙醇以1∶500的比例混合而得。彩色微球，加拿大圣地亞哥Triton Technologies公司。微球懸浮溶液（microsphere carrier solution，MCS；10%吐溫80與生理鹽水以1∶200的比例混合）的配置均按照Triton Technologies公司給出的步驟配置。

1.2 動物模型制備與分組

將SD大鼠分為3組。（1）正常組：6只，生理鹽水2 mL/kg皮下注射，每周2次，共14周。（2）門靜脈高壓組：7只，采用CCl4皮下注射法誘導(dǎo)肝硬化門靜脈高壓癥模型［7］，50% CCl4玉米油溶液2 mL/kg皮下注射，每周2次，共14周，同時自第8周起飲5%乙醇至14周。（3）PEG-CAT組：6只，造模方法同實驗組，同時自第12周起，每天腹腔注射PEG-CAT 10 000 U/kg （40 000 U溶于5 mL生理鹽水，并于注射前經(jīng)0.22 μm濾網(wǎng)過濾）。

1.3 檢測方法

1.3.1 血流動力學(xué)測定［8］：大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（生理鹽水配置，2 mL/kg）麻醉后固定于手術(shù)臺，右側(cè)頸動脈插入PE-50導(dǎo)管至左心室用于注射黃色微球，右側(cè)股動脈插入PE-50導(dǎo)管，上述操作結(jié)束后穩(wěn)定30 min，經(jīng)左心室導(dǎo)管勻速注入180 μL含30萬U黃色微球溶液并用120 μL生理鹽水沖洗，注射持續(xù)時間為50 s。黃色微球注入前10 s，用注射器泵以1 mL/min的速度從右側(cè)股動脈抽取標(biāo)準(zhǔn)血樣，持續(xù)75 s。10 min后氯化鉀處死大鼠。將大鼠肺、肝臟、小腸、胃、胰腺、脾臟、結(jié)腸及腸系膜取出，吸干多余水分及清除腸道內(nèi)容物后精確稱重。

標(biāo)準(zhǔn)血樣及所取組織均按照Triton Technologies公司給出的步驟分別使用BHR以及ADR、AE消化，并加入1000 U藍(lán)色微球作為質(zhì)控。將所得微球用MCS懸浮后檢測吸光度（黃色及藍(lán)色微球吸光波長分別為448及672 nm），并按照如下公式求得血流動力學(xué)指標(biāo)?？偼庵茏枇Γ╰otal peripheral resistance，TPR）=MAP/CO（mmHg·min·mL-1）；組織（小腸、腸系膜等）血流=Qr×（As/Ar），AS代表組織標(biāo)本黃色微球吸光度值，單位為mL/min；門脈血流（portal flow，PF）為所取內(nèi)臟血流總和，單位為mL/min；門脈血流阻力（portal flow resistance，PFR）=（MAP-PP）/ PF（mmHg·min·mL-1）。

1.3.2 組織過氧化氫含量測定：依據(jù)碧云天公司所提供產(chǎn)品使用說明，使用過氧化氫檢測試劑盒檢測小腸組織、腸系膜組織過氧化氫含量。計算并除以樣品蛋白含量，所得比值即為組織過氧化氫含量，單位nmol/mg。

1.3.3 Western blotting法檢測蛋白表達(dá)：檢測小腸及腸系膜組織VEGF（抗體1∶200配置）、VEGFR2（抗體1∶100配置）及CD31（抗體1∶200配置）表達(dá)并用GAPDH作為上樣參照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PEG-CAT對大鼠臟器血流動力學(xué)影響

實驗組大鼠平均動脈壓（MAP）較正常組顯著降低（P＜0.05），與門靜脈高壓組比，PEG-CAT干預(yù)對血壓無明顯改變（P＞0.05），且三組間心輸出量（CO）及總外周阻力（TPR）無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），說明PEG-CAT干預(yù)對全身血流動力學(xué)無顯著影響。見表1和圖1。

表1　三組體重及血流動力學(xué)資料

圖1　三組大鼠間總外周阻力比較

同時，我們分別檢測了三組大鼠主要內(nèi)臟血流變化（表1），發(fā)現(xiàn)與正常組相比，實驗組大鼠除胰腺及結(jié)腸血流無統(tǒng)計學(xué)差異外（P值分別為0.078和0.058），其他各內(nèi)臟血流均較正常組顯著升高（P＜0.05），PEG-CAT治療后可顯著降低上述各內(nèi)臟器官血流量。之后我們進(jìn)一步計算了各內(nèi)臟器官血流量總和并進(jìn)行三組間比較（圖2a），發(fā)現(xiàn)PEG-CAT治療后的確可顯著降低肝硬化門靜脈高壓癥大鼠總門靜脈血流。由于PEG-CAT治療對已升高的門靜脈壓力無顯著影響（P＞0.05，表1），進(jìn)一步比較了各組大鼠門靜脈血流的阻力，即血液流入門靜脈時受到的阻力，我們發(fā)現(xiàn)PEG-CAT治療后，可顯著增加門靜脈血流阻力，但依然顯著低于正常組大鼠（P＜0.05，圖2b），其原因可能是由于肝硬化門靜脈高壓癥的降血壓作用以及PEG-CAT治療并無明顯升壓作用所造成的，但以上實驗結(jié)果足以提示，過氧化氫對肝硬化門靜脈高壓癥大鼠內(nèi)臟異常高血流動力狀態(tài)的形成具有明顯促進(jìn)作用，而PEG-CAT治療可顯著改善門靜脈高壓癥異常的血流動力學(xué)變化。

2.2 PEG-CAT對小腸及腸系膜過氧化氫含量的影響

實驗結(jié)果如圖3所示，肝硬化門靜脈高壓癥大鼠小腸及腸系膜中過氧化氫含量顯著升高，分別高出正常組約2倍和0.7倍，PEG-CAT干預(yù)后其含量顯著降低（P＜0.05），且與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。結(jié)合圖2所示，這些結(jié)果進(jìn)一步明確清除過氧化氫對肝硬化門靜脈高壓癥具有明顯治療作用。

2.3 PEG-CAT對血管形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

我們進(jìn)一步檢測了三組大鼠小腸及腸系膜VEGF、VEGFR2及CD31三種血管形成相關(guān)蛋白表達(dá)的變化情況（圖4a），圖4b則為三次免疫印記測定的合計定量數(shù)值。統(tǒng)計表明，VEGF、VEGFR2及CD31三種血管新生相關(guān)蛋白在門高壓大鼠均顯著升高。在小腸組織，三種蛋白表達(dá)升高約4倍，在腸系膜其升高約達(dá)2倍。使用PEG-CAT降低組織過氧化氫含量后，三種蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），說明PEG-CAT可以通過降低氧化氫含量而減少新生血管形成，從而減少門高壓大鼠內(nèi)臟血流量的升高。

與正常組比，*P＜0.05；與門靜脈高壓組比，#P＜0.05 圖2 三組大鼠門靜脈血流及阻力的比較

與正常組比，*P＜0.05；與門靜脈高壓組比，#P＜0.05 圖3 小腸及腸系膜組織過氧化氫（H2O2）含量測定

3 討論

在本研究中，我們主要探索了機(jī)體氧化應(yīng)激的產(chǎn)物過氧化氫在門靜脈高壓癥肝外環(huán)境中的作用。通過使用結(jié)合有聚乙二醇的過氧化氫抑制劑PEGCAT，不僅可以使細(xì)胞內(nèi)外的過氧化氫得到降解，降低過氧化氫含量。通過過氧化氫檢測試劑盒檢測小腸及腸系膜過氧化氫的含量，我們也驗證了這一藥物的有效性。更重要的是，本研究證實了在門靜脈高壓癥大鼠小腸及腸系膜組織中，過氧化氫含量顯著增高，而活體注射PEG-CAT可以使過氧化氫含量恢復(fù)至正常水平（圖3）。這不僅與之前的研究中提到的門靜脈高壓癥機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增高觀點相符合［4-5］，同時本實驗更進(jìn)一步研究了過氧化氫這一特定的氧化應(yīng)激產(chǎn)物，并通過定量的方式明確了不同組織氧化應(yīng)激的水平是不同的，為我們之后研究門靜脈高壓癥肝外高動力循環(huán)打下了堅實的方法學(xué)基礎(chǔ)。

1：正常組；2：門靜脈高壓組；3：PEG-CAT組；a：小腸；b：腸系膜與正常組比，*P＜0.05；與門靜脈高壓組比，#P＜0.05圖4 Western blotting法檢測CD31，VEGF以及VEGFR2蛋白表達(dá)情況

過氧化氫已在其他疾病的相關(guān)研究中被證實具有促進(jìn)血管生成的作用［9］，其本身更是一種重要的細(xì)胞內(nèi)第二信使［10］，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。而在門靜脈高壓癥機(jī)體的腸系膜及小腸中，血管形成相關(guān)蛋白VEGF及CD31已被證實是升高的［11］，腸系膜上動脈血流量也相應(yīng)增多。因此小腸及腸系膜組織中升高的過氧化氫與增多的新生血管之間的聯(lián)系值得進(jìn)一步探索。通過使用PEG-CAT抑制過氧化氫含量后，不僅是VEGF、CD31以及VEGFR-2的表達(dá)也下降（圖4），這不僅證實了過氧化氫確實在肝硬化門靜脈高壓癥體內(nèi)參與了新生血管的形成，也使PEG-CAT未來進(jìn)一步臨床應(yīng)用的可能性得到肯定。本實驗的不足之處在于我們并未進(jìn)一步探索其他肝外臟器過氧化氫的含量，但這些臟器的血流量也是改變的（表1），主要是由于通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計后，我們發(fā)現(xiàn)小腸及腸系膜血流量的改變對門靜脈壓力的影響最為顯著。關(guān)于其他臟器過氧化氫含量的改變對門靜脈高壓癥發(fā)生發(fā)展的影響將會是我們之后的研究內(nèi)容，并結(jié)合現(xiàn)有研究結(jié)果得出更加詳實的結(jié)論。

在新生血管形成因PEG-CAT的使用而得到緩解后，門靜脈高壓癥大鼠的門靜脈壓力卻未得到降低（圖1），但結(jié)合其他數(shù)據(jù)如門靜脈血流阻力及門靜脈血流量（圖2），我們可以證實抑制過氧化氫確實能夠有效地改善門靜脈高壓癥機(jī)體內(nèi)異常的全身血流循環(huán)。因為在臨床實際治療及疾病嚴(yán)重程度評定中，門靜脈壓力早已不是作為評判門靜脈高壓癥嚴(yán)重程度的標(biāo)準(zhǔn)之一，肝靜脈楔壓（hepatic venous pressure gradient，HVPG）已被證實與門靜脈高壓癥并發(fā)癥的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)并作為提示患者預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)之一［12］。而本實驗中并未改變的門靜脈壓力本身存在受其他多種因素影響的可能性，而器官血流量的改變已足以證明過氧化氫的作用以及PEG-CAT作為未來治療肝外異常血流藥物的可能性。在我們之后的研究中，我們將考慮采用測量HVPG進(jìn)一步確保實驗結(jié)果的可靠性。

本研究提示，氧化應(yīng)激及活性氧確實可作為治療門靜脈高壓癥的治療靶點，同時PEG-CAT活體使用的可行性也得到了論證［13］。

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（本文編輯：張和，魯翠濤）

［中圖分類號］R575.2

［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A

Doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.04.005

［收稿日期］2016-01-30

［基金項目］國家自然科學(xué)基金項目（81370548）。

［第一作者簡介］何越（1990-），男，浙江寧波人，在讀碩士。

［通訊作者簡介］羅蒙，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，博士，E-mail：luotysy@sina.com。Protein expressions of VEGF， VEGFR-2 and CD31 were well blocked by PEG-CAT. Conclusion PEG-CAT can reduce protein expressions of angiogenesis markers in portal hypertensive rats via blockage of H2O2. Moreover，although blockage of H2O2will not be able to reduce portal pressure， portal venous flow is reduced significantly which indicates potential possibility of considering blockage of H2O2as future treatment target in portal hypertension.

PEG-CAT ameliorates hyperdynamic splanchnic circulation in hepatic cirrhosis and portal hypertension rats

HE Yue1， SHI Dan-li2， QIN Jun1， LUO Meng3. 1Department ofGeneral Surgery， RenjiHospital Affiliated to School of Medcine， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200127， China； 2Department of General Surgery， Shanghai Third People’s Hospital Affiliated to School of Medicine， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200127， China；3Department of General Surgery， the 9thPeople’s Hospital Affiliated to School of Medcine， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200011， China

Abstractobjective To investigate the influence of PEG-CAT in the regulation of hyperdynamic splanchnic circulation in portal hypertensive rats， and to verify the effects of super oxide on portal hypertension. Methods Portal pressure was measured in normal rats （n=6）， carbon tetrachloride treated rats （n=7）， as well as rats treated with PEG-CAT （n=6）. The hemodynamic studies were performed by colored microsphere technique. The H2O2level was measured with the Hydrogen Peroxide Assay Kit. Protein expressions of angiogenesis markers were determined with Western blotting. Results （1） The portal pressures had a significant difference between normal rats and portal hypertensive rats， but there was no difference between portal hypertension group and catalase-treated group. （2） Compared with the control group， the blood flows of intestine， stomach， mesentery and spleen were elevated significantly and treatment of PEG-CAT could reduce blood flow of these organs. （3） Portal hypertensive rats had a higher expression of H2O2in mesentery and intestine which would be blocked by PEG-CAT. （4）

Key wordsliver cirrhosis； portal hypertension； hydrogen peroxide； rats