王禮鳳 宋春蓉 曹寧 齊婧 魚富麗 鄭旭銳 惠毅

摘要：目的 觀察新加達(dá)原飲對(duì)慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血樹突狀細(xì)胞（DCs）的影響。方法 對(duì)20例CHB患者均給予新加達(dá)原飲治療，療程12周。于治療前及治療4、8、12周時(shí)采集抗凝外周靜脈血，分離擴(kuò)增單個(gè)核細(xì)胞中DC，流式細(xì)胞法檢測DC表型，同步檢測患者丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）及HBV DNA水平，并以10例健康人作為正常對(duì)照。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，CHB患者外周血DCs表面CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR表達(dá)顯著下降（P<0.01）。經(jīng)新加達(dá)原飲治療后，DCs表面分子表達(dá)水平均提高，在治療12周時(shí)最顯著（P<0.01）。與治療前比較，CHB患者治療后ALT升高，于治療8周時(shí)最顯著（P<0.01），治療12周時(shí)明顯下降（P<0.01）；HBV-DNA水平下降，治療12周時(shí)下降最顯著（P<0.01）。結(jié)論 CHB患者外周血DCs表面分子表達(dá)水平低下，新加達(dá)原飲能上調(diào)DC表型表達(dá)。

關(guān)鍵詞：慢性乙型肝炎；新加達(dá)原飲；樹突狀細(xì)胞

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.007

中圖分類號(hào)：R259.126.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）08-0024-04

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的，以肝臟炎性病變?yōu)橹鞯囊环N傳染性疾

基金項(xiàng)目：陜西省中醫(yī)管理局中醫(yī)藥科研課題（13-LC074）

病，宿主免疫狀態(tài)是決定乙型肝炎臨床轉(zhuǎn)歸和療效的最主要因素[1]。近年來國內(nèi)外研究提示，造成慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）感染慢性化的機(jī)制與機(jī)體內(nèi)樹突狀細(xì)胞（DCs）抗原遞呈功能缺陷，不能把病毒抗原的信號(hào)傳遞給機(jī)體的免疫系統(tǒng)有關(guān)[2-6]。新加達(dá)原飲是在明代醫(yī)家吳又可創(chuàng)立的達(dá)原飲基礎(chǔ)上，經(jīng)過長期臨床實(shí)踐加減變化組成的經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)CHB具有較好治療效果[7-9]。本研究以3個(gè)月為1個(gè)療程，觀察其對(duì)CHB患者外周血DCs的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

20例均為2013年7月-2014年12月陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診患者。其中男14例，女6例，年齡20～54歲，平均年齡（32.4±10.2）歲，病程2～21年。另以10例健康人作為正常對(duì)照，均為陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院職工。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

CHB診斷依據(jù)2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合上述CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)，半年內(nèi)未服用任何抗病毒藥物和免疫調(diào)節(jié)劑治療，且不屬于排除標(biāo)準(zhǔn)任何一項(xiàng)的病例。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

血清膽紅素≥34.2 ?mol/L；ALT>400 U/L；血清白蛋白≤30 g/L；重疊感染其他肝炎病毒（如甲、丙、丁、戊型肝炎病毒等），合并肝硬化、肝癌、脂肪肝；合并心腦、肺、腎等器質(zhì)性疾病及造血系統(tǒng)嚴(yán)重疾病、精神病患者；年齡>65歲或<18歲妊娠或哺乳期婦女；未按規(guī)定服藥者。

2 方法

2.1 治療藥物

所有患者均服用新加達(dá)原飲散劑（草果6 g，檳榔10 g，黃芩15 g，白芍12 g，厚樸10 g，柴胡15 g，丹參20 g，姜黃10 g，葉下珠15 g，僵蠶10 g，蟬蛻10 g，靈芝10 g等，藥物飲片均購自北京同仁堂，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠凈化烘焙處理后，制成散劑），5 g，口服，每日3次。連續(xù)治療12周為1個(gè)療程。治療期間禁止服用任何其他抗病毒藥物和保肝降酶藥物。

2.2 主要試劑

淋巴細(xì)胞分離液，上海博升公司，批號(hào)20140506；重組人白細(xì)胞介素4（rh IL-4），美國Peprotech公司，批號(hào)20131103；重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rh GM-CSF），美國 Peprotech公司，批號(hào)20131217；RPMI-1640，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；10%胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)CS），美國Hyclone公司，批號(hào)20140123；熒光標(biāo)記鼠抗人HLA-DR-PE（藻紅蛋白熒光素，批號(hào)20131220）、CD80-FITC（異硫氰酸熒光素，批號(hào)20131125）、CD86-PE（批號(hào)20131214）、CD1a-FITC（批號(hào)20140210），美國 ebioscience公司；磷酸鹽緩沖液（PBS），江蘇寶萊公司，批號(hào)20140312；噻唑蘭（MTT，批號(hào)20131015）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)20130925），美國Sigma公司。

2.3 觀察指標(biāo)

于治療前及治療4、8、12周時(shí)，檢測患者肝功能指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），熒光PCR法檢測HBV-DNA水平，流式細(xì)胞儀檢測CD80、CD86、HLA-DR、CD-1α。

2.4 樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)及表型檢測

參照Romani等[11]分離培養(yǎng)DCs的方法稍作修改。無菌條件下抽取人外周血20 mL，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），PBS洗滌2次，RPMI1640洗滌1次。用含10% FCS RPMI 1640液調(diào)整外周血PBMCs濃度為3×106/mL，移植入6孔培養(yǎng)板，每孔3 mL。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2 h，吸棄培養(yǎng)上清液，37 ℃預(yù)熱RPMI 1640液輕輕洗滌培養(yǎng)板2次，去除非貼壁細(xì)胞，即獲得貼壁的單個(gè)核細(xì)胞。向去除非貼壁細(xì)胞的6孔培養(yǎng)板每孔內(nèi)各加10% FCS RPMI 1640培養(yǎng)液3 mL，其中含有GM-CSF 100 ?g/L、IL-4 500 U/mL，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔日換液1次，吸棄原液1.5 mL，加同體系培養(yǎng)液1.5 mL。收集第7日懸浮細(xì)胞，即為DCs，用PBS洗細(xì)胞2次，稀釋成5×105/ml，加入鼠抗人CD80-FITC、CD86-PE、HLA-DR-PE、CD-1α-FITC各20 ?L，輕輕混勻，4 ℃溫育45 min，再用PBS洗2次，流式細(xì)胞儀檢測DCs的表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用 —x±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，治療前后均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 治療前后患者肝功能及乙型肝炎病毒DNA比較

治療過程中，CHB患者ALT一度升高，于治療8周時(shí)升高明顯，但隨治療時(shí)間延長逐漸下降，于治療12周時(shí)基本恢復(fù)正常。治療后患者HBV-DNA水平下降。結(jié)果見表1。

3.2 正常對(duì)照組與慢性乙型肝炎患者治療前后樹突狀細(xì)胞表型表達(dá)比較

與正常對(duì)照組比較，CHB患者組外周血DCs表面CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR的表達(dá)水平顯著下降（P<0.01）。給予新加達(dá)原飲治療后，CHB患者組外周血DCs表面CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR的表達(dá)水平均升高，且在治療12周時(shí)最顯著（P<0.01）。結(jié)果見表2。

4 討論

DC是起源于骨髓的專職抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），具有啟動(dòng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答功能，其功能狀態(tài)直接影響細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。DC也是唯一可激活初始型免疫反應(yīng)的細(xì)胞，是最強(qiáng)大的次級(jí)免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)物，是免疫應(yīng)答的始動(dòng)者。研究表明，CHB患者存在DC功能缺陷。HBV及其抗原可造成DC數(shù)量、表型和功能的異常[5，12]。CHB患者體內(nèi)DC細(xì)胞功能缺陷，使HBV病毒粒子和抗原成分直接抑制DC細(xì)胞的表型成熟和功能活化，從而使DC細(xì)胞不能有效遞呈HBV抗原給T淋巴細(xì)胞[13]。對(duì)慢性HBV感染者的研究也發(fā)現(xiàn)，感染者外周血DC表面的CD1α、HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)水平低于健康者[14]。

中醫(yī)關(guān)于CHB發(fā)病機(jī)制正邪關(guān)系的論述，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于HBV感染造成機(jī)體免疫功能損傷，致病毒持續(xù)不能得到清除以使乙肝慢性化甚至導(dǎo)致肝硬化、肝癌發(fā)生的機(jī)制不謀而合。中醫(yī)認(rèn)為HBV屬外感邪氣，從HBV引起急慢性肝炎的臨床表現(xiàn)來看，HBV同時(shí)具有濕、熱、毒邪的特點(diǎn)。HBV侵犯人體后，濕熱疫毒之邪蘊(yùn)結(jié)中焦，影響肝膽脾胃的正常生理功能，致使脾胃失健、肝郁氣滯。日久邪氣結(jié)而不去，由氣入血，病久入腎，造成瘀血內(nèi)停，肝脾腎虧損。脾為后天之本，腎為先天之本，是人體正氣的源泉和根本。HBV感染后虛實(shí)夾雜，濕、熱、毒、瘀互結(jié)，邪盛不斷傷正，正虛不能驅(qū)邪外出，形成惡性循環(huán)，遂致病情遷延難愈。新加達(dá)原飲正是基于這樣的病因病機(jī)認(rèn)識(shí)創(chuàng)立的有效方劑，始終堅(jiān)持扶正以助祛邪，祛邪不忘扶正，全面激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答發(fā)揮抗病毒作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，CHB患者外周血DCs表面CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR的表達(dá)顯著下降，經(jīng)新加達(dá)原飲治療3個(gè)月，可以使患者DCs表面分子表達(dá)水平顯著提高。

研究中我們還觀察到，20例患者中有5例在開始治療時(shí)無任何癥狀，具有不同程度消化道癥狀者12例，僅感腰部酸困、失眠者3例。治療4周時(shí)，腰酸及失眠者癥狀消失，其他患者癥狀改善不明顯。在治療8周時(shí)，有8例患者訴納差加重，但隨著治療時(shí)間的延長，癥狀逐漸減輕；原來5例無癥狀患者中有4例在治療4周時(shí)出現(xiàn)大便溏、輕度腹脹，在治療8周時(shí)癥狀明顯，隨著治療時(shí)間的延長，癥狀減輕，至12周療程結(jié)束，所有患者癥狀基本消失?；颊吒喂δ苤笜?biāo)（ALT）在開始治療后均升高，但病毒水平并未出現(xiàn)相應(yīng)增長，而是持續(xù)降低；隨著治療時(shí)間的延長，ALT逐漸恢復(fù)正常，此時(shí)病毒量進(jìn)一步下降。在這一過程中并未增加任何保肝措施，由此推測，藥物通過上調(diào)DCs的功能，激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，增強(qiáng)了機(jī)體正氣祛邪外出的能力，從而使?jié)駸岱安粩嗤赋?，引起或加重腹脹、便溏、納差等癥狀表現(xiàn)；同時(shí)發(fā)揮了抗病毒的作用，進(jìn)而使肝細(xì)胞在病毒清除過程中暫時(shí)受到損害而致肝功能異常。

總之，新加達(dá)原飲可以通過增強(qiáng)DCs的功能而發(fā)揮抗HBV的作用，可以用于CHB的治療。本研究由于經(jīng)費(fèi)有限，觀察周期較短，尚無法全面揭示其抗病毒機(jī)制。在通過激發(fā)免疫應(yīng)答徹底清除乙肝病毒這一治療過程中，免疫清除的重要標(biāo)志——轉(zhuǎn)氨酶升高[15]是判斷療效和預(yù)后的重要指標(biāo)。如何控制肝功能的異常程度即ALT升高的水平，才更加有利于抗病毒，獲得完全應(yīng)答，還需要更多的研究來確定，以防止發(fā)生肝功能失代償現(xiàn)象。

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