張代玉，吳 凡，張吉宇，王彥榮，張 巖，羅 棟

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院， 甘肅 蘭州 730020)

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秋水仙素和60Co-γ射線對無芒隱子草種子萌發(fā)的影響

張代玉，吳 凡，張吉宇，王彥榮，張 巖，羅 棟

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院， 甘肅 蘭州 730020)

摘要：通過不同劑量秋水仙素和60Co-γ射線處理，系統(tǒng)分析了無芒隱子草(Cleistogenes songorica)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及幼苗生長。結(jié)果表明，秋水仙素處理對無芒隱子草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)有一定程度的抑制作用，經(jīng)0.1%濃度處理48 h的種子，其發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別為對照組的54.3%和43.3%，分別是41%和0.55；不同劑量60Co-γ射線對無芒隱子草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及幼苗生長產(chǎn)生不同的影響。低劑量(50～200 Gy)提高種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，高劑量(400～2 000 Gy)抑制種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及幼苗生長。其中，600 Gy輻射處理的發(fā)芽率為48.5%。因此，0.1%濃度處理48 h和600 Gy可分別作為秋水仙素和60Co-γ射線處理的半致死劑量。本研究初步確定的半致死劑量，可為進一步研究無芒隱子草種質(zhì)資源創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：無芒隱子草；秋水仙素；60Co-γ射線；發(fā)芽

植物誘變技術(shù)可通過利用外界因素在短時間內(nèi)獲得有價值的突變體，是育成新品種和創(chuàng)造新種質(zhì)資源的重要方法。20世紀以來，人們在植物創(chuàng)造突變體領(lǐng)域已取得了豐碩的成果，其研究方法主要包括疊氮化物、烷化劑和抗生素類等化學誘變和紫外線、X射線、γ射線、離子束和激光處理等物理誘變[1]，其主要對象為大豆(Glycinemax)、高粱(Sorghumbicolor)、小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamay)等農(nóng)作物[2-5]。我國牧草育種研究工作起步尚晚，種質(zhì)資源匱乏，迫切需要育成創(chuàng)新種質(zhì)資源。目前關(guān)于牧草誘變及應用的研究尚少。王文恩等[6]以60Co-γ射線對狗牙根(Cynodondactylon)種子進行了誘變效應的研究，得出輻射劑量大于350 Gy時, 抑制干種子發(fā)芽且隨著劑量增大而加強。鮑智娟和邢秀芹[7]用不同濃度的秋水仙素對甘草(Glycyrrhiazuralensis)萌動種子經(jīng)不同時間處理后，結(jié)果表明，0.2%濃度秋水仙素處理24 h效果最好。房永雨等[8]利用不同濃度秋水仙素和不同處理時間對高丹草(Sorghumsudanense)雜交F1種子的誘變效果進行了分析，發(fā)現(xiàn)適宜的秋水仙素濃度和時間處理組合分別為0.1%、24 h和0.05%、36 h。

無芒隱子草(Cleistogenessongorica)為多年生禾本科植物，是我國西北荒漠草原的重要優(yōu)良牧草資源[9-11]，主要分布于中國內(nèi)蒙古、陜西、寧夏、甘肅、青海及新疆等地，具有抗旱、耐寒等特點，對促進西北地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展和維持脆弱生態(tài)系統(tǒng)具有重要作用[12]。前人對無芒隱子草的萌發(fā)[13]、抗旱功能基因[14]以及氮肥對其產(chǎn)量的影響[15]等做了研究，而秋水仙素和60Co-γ射線對其種子的萌發(fā)及幼苗生長尚未見報道。本研究以內(nèi)蒙古阿拉善荒漠草原的無芒隱子草種子為材料，研究秋水仙素和60Co-γ射線對其種子發(fā)芽及幼苗生長的影響，旨在為無芒隱子草種質(zhì)資源創(chuàng)新提供有價值的參考。

1材料與方法

1.1材料

無芒隱子草種子于2010年9月采自內(nèi)蒙古阿拉善荒漠草原，將種子貯藏在4℃恒溫種質(zhì)庫中待用。

1.2方法

1.2.1不同劑量秋水仙素對種子的處理參考張煥玲等[16]用秋水仙素對杜仲(Eucommiaulmoides)種子誘變的研究，在室溫下，用質(zhì)量分數(shù)0.05%、0.1%、0.2%和0.3%的無菌秋水仙素分別浸泡種子24和48 h，然后用消毒的紗布將種子包起來清水沖洗1～2 h，每個處理100粒種子，4次重復，以未經(jīng)處理的種子作為對照。

1.2.2不同輻射劑量60Co-γ射線對種子的處理將無芒隱子草干種子裝入硫酸紙小袋，參考云錦鳳[17]對不同牧草輻照劑量的研究結(jié)果，于2013年9月4日利用60Co-γ射線在蘭州輻射技術(shù)開發(fā)中心輻射研究所進行輻射，輻射劑量分別為50、100、200、400、600、800、1 000和1 200 Gy，每個處理100粒種子，4次重復，以未經(jīng)處理的種子作為對照。

1.2.3發(fā)芽試驗將未經(jīng)處理的和不同誘變處理后的種子鋪于濾紙上晾干，所有種子用0.1%氯化汞消毒10 min，無菌水沖洗至少3次，后置于鋪有兩層濾紙(去離子水濕潤)的培養(yǎng)皿(直徑為10 cm)中，25 ℃下培養(yǎng)(16 h光照和8 h黑暗)，每皿100粒種子，4次重復，以后每天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，當胚根長度大于1 mm統(tǒng)計為發(fā)芽，持續(xù)14 d，第12～14天無種子發(fā)芽，則試驗結(jié)束。第7天每培養(yǎng)皿均隨機取10株各處理幼苗，測定胚根和胚芽長并計算其發(fā)芽指數(shù)。發(fā)芽指數(shù)(GI)[18]的計算公式為：GI= ∑(Gt/Dt)。Gt代表發(fā)芽第1,2,3，...,t,7天的種子發(fā)芽率，Dt為相應的種子發(fā)芽天數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2007進行統(tǒng)計及制圖，并應用SPSS 16.0軟件以LSD多重比較及Duncan’s檢驗進行差異性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1不同劑量秋水仙素對無芒隱子草種子萌發(fā)的影響

不同濃度秋水仙素處理24和48 h的種子發(fā)芽率均低于對照，且24 h處理的種子發(fā)芽率高于48 h處理的，表明不同濃度的秋水仙素對無芒隱子草種子發(fā)芽有一定的抑制作用(圖1)。在所有處理中，0.3%秋水仙素浸種處理48 h的種子最終發(fā)芽率最低，為31%；0.3%秋水仙素浸種處理24 h的種子最終發(fā)芽率最高，為66.5%；0.1%秋水仙素處理48 h的種子最終發(fā)芽率是41%，為對照組發(fā)芽率的54.3%。

經(jīng)不同濃度秋水仙素處理的無芒隱子草種子培養(yǎng)7 d后，各處理下的無芒隱子草發(fā)芽指數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05)(圖2)。供試秋水仙素處理中，0.3%浸種處理24 h的種子的發(fā)芽指數(shù)顯著高于其它處理的；0.3%濃度處理48 h的種子發(fā)芽指數(shù)在所有處理中最低，為0.42；0.1%秋水仙素處理48 h的種子發(fā)芽指數(shù)為0.55，是對照組發(fā)芽指數(shù)的43.3%。

圖1　秋水仙素處理對無芒隱子草種子發(fā)芽的影響

圖2　秋水仙素處理對無芒隱子草發(fā)芽指數(shù)的影響

注:不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lower case letters indicate significant difference among different treatments at 0.05 level. The same below.

2.2不同劑量秋水仙素對無芒隱子草幼苗生長的影響

不同濃度秋水仙素處理的種子培養(yǎng)7 d后，無芒隱子草幼苗長顯著小于對照的(P<0.05)(圖3)，表明秋水仙素對無芒隱子草的幼苗生長具有明顯的抑制作用。不同處理間的幼苗胚芽長差異顯著。當處理時間一定時，隨秋水仙素濃度的升高，無芒隱子草種子胚根、胚芽長呈下降趨勢，表明秋水仙素對無芒隱子草幼苗生長的抑制作用隨藥劑濃度升高而增強。當處理濃度相同時，24 h處理的種子胚根、胚芽長均大于48 h處理的，表明秋水仙素對無芒隱子草幼苗生長的抑制作用隨藥劑處理時間延長而增強。

2.3不同劑量60Co-γ射線處理對無芒隱子草種子發(fā)芽的影響

不同劑量的60Co-γ射線輻射無芒隱子草種子后，其發(fā)芽率不同。50、100和200 Gy 3個輻射劑量的輻照處理均促進了無芒隱子草種子的發(fā)芽，發(fā)芽率分別為85.0%、84.5%和84.0%，但與對照無顯著差異(P>0.05)(圖4)。其它輻射劑量處理后的種子發(fā)芽率顯著低于對照(P<0.05)，其中1 000和1 200 Gy的高輻射劑量延緩了種子發(fā)芽。

不同劑量60Co-γ射線輻射處理的無芒隱子草種子培養(yǎng)7 d后，經(jīng)50、100和200 Gy 3個輻射劑量處理的無芒隱子草種子發(fā)芽指數(shù)均顯著高于對照(P<0.05)的(圖5)，表明低劑量60Co-γ射線處理明顯促進無芒隱子草的早期發(fā)芽。供試其它輻射劑量處理的無芒隱子草種子發(fā)芽指數(shù)均顯著低于對照(P<0.05)，其中，1 000和1 200 Gy 兩個輻射劑量的發(fā)芽指數(shù)低，且兩者間無顯著差異，表明高劑量的60Co-γ射線輻射對無芒隱子草種子前期發(fā)芽具有明顯的抑制作用。

圖3　秋水仙素對無芒隱子草幼苗胚根與胚芽長的影響

圖4　60Co-γ射線處理對無芒隱子草種子發(fā)芽的影響

圖5　60Co-γ射線處理對無芒隱子草發(fā)芽指數(shù)的影響

2.4不同劑量60Co-γ射線處理對無芒隱子草幼苗生長的影響

無芒隱子草種子經(jīng)不同劑量60Co-γ射線處理后，50和200 Gy輻射劑量下，萌發(fā)7 d后的幼苗胚芽長均顯著高于對照(P<0.05)；1 200 Gy輻射劑量下無芒隱子草幼苗的胚根(0.5 cm)和胚芽長(0.55 cm)最小，顯著低于對照的胚根(1.69 cm)和胚芽長(1.06 cm)，表明高劑量輻射顯著抑制了幼苗生長。

圖6　60Co-γ射線處理對無芒隱子草胚根和胚芽長的影響

3討論與結(jié)論

化學誘變劑秋水仙素阻止染色體分離，加倍體細胞的染色體數(shù)量，可經(jīng)進一步誘導形成多倍體植株，但對染色體的結(jié)構(gòu)無顯著影響，且很少發(fā)生不良變異，因此在誘變育種中被廣泛利用[19]。由于秋水仙素對植物材料有毒害作用，若處理不當，常常使材料在處理過程中死亡，影響成苗率，但不同植物、品種或器官對秋水仙素的敏感程度不同，因此篩選適宜的誘變劑濃度和處理時間尤為重要。在加倍玉米單倍體效率的研究中，得出秋水仙素質(zhì)量濃度為0.4～1.0 mg·L-1時單倍體玉米的加倍率是5.5%～16.5%[20]。利用秋水仙素對青島百合(Liliumtsingtauense)進行浸種誘導多倍體，結(jié)果表明，以0.05%的秋水仙素處理24 h，誘導效果最佳[21]。利用不同濃度秋水仙素和處理時間處理日本矮紫薇(Lagerstroemiaindica)種子，結(jié)果表明，隨著處理濃度的增加和處理時間的延長，其發(fā)芽率下降[22]。用秋水仙素處理地錦(Parthenocissustricuspidata)體胚，結(jié)果表明，0.05%秋水仙素處理48 h以上對地錦體胚萌發(fā)有顯著抑制作用[23]。本研究表明，處理時間的延長發(fā)芽率降低，這與穆紅梅等[22]的研究結(jié)論一致。其中，0.1%濃度秋水仙素處理48 h無芒隱子草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別為41%和0.55，均為對照組的50%，并且對幼苗生長的抑制作用不明顯，因此，0.1%秋水仙素處理48 h可初步確定為秋水仙素誘變的最適宜劑量。

前人研究表明，生姜(Rhizomazingiberis)[24]、石斛蘭(Dendrobium)[25]、非洲菊(Gerberajamesonii)[26]等植物均隨秋水仙素濃度的升高或處理時間的延長，受害程度加重，種子成活率等指標呈下降趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，秋水仙素處理對無芒隱子草的發(fā)芽具有一定的抑制作用，且發(fā)芽率隨處理時間延長而降低，但是發(fā)芽率隨著處理濃度變化并無明顯的規(guī)律。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是因為秋水仙素處理種子受多個因素影響，如藥劑的濃度、處理的時間、誘變材料自身的性質(zhì)、誘變材料的抗逆性等，其中種子的保護程度是一個非常重要的因素。在生產(chǎn)實踐中，無芒隱子草的種子有稃片保護，所以藥劑滲透時間應較長。

60Co-γ射線能量高、穿透力強、射程遠，故一次可照射很多種子，而且劑量較均勻，是輻射誘變育種中最常用的誘變源。很多研究[27-29]表明，低劑量的輻射處理對種子發(fā)芽具促進作用，而高劑量的輻射抑制種子發(fā)芽且對種胚產(chǎn)生傷害，出現(xiàn)低劑量輻射促進植物生長、提高發(fā)芽率的原因可能是因為種子內(nèi)生物自由基或有關(guān)酶的活性經(jīng)輻射處理后產(chǎn)生了變化，進而加快了種子的代謝，對種子的發(fā)芽產(chǎn)生促進作用。王月華等[30]證實，低劑量的60Co-γ射線處理促進草地早熟禾(Poapratensis)種子的萌發(fā)。蔡春菊等[31]曾提到高劑量的60Co-γ射線處理對毛竹(Phyllostachysedulis)的種胚組織產(chǎn)生了傷害作用，抑制了細胞的分裂，延緩了毛竹種子的萌發(fā)。本研究中使用低劑量(50、100和200 Gy)的60Co-γ射線輻射, 在無芒隱子草中出現(xiàn)了種子發(fā)芽率不同程度地高于對照，且發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均高于其它處理，其中100 Gy對無芒隱子草的胚根長抑制作用最小。其它輻射劑量處理后的種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均低于對照，采用600 Gy60Co-γ射線輻射無芒隱子草種子，最終發(fā)芽率為48.5%。

誘變育種中，適宜誘變劑量是誘變成功的關(guān)鍵。除種子萌發(fā)和幼苗生長外，田間出苗情況、酶活性等生理代謝指標及細胞有絲分裂指數(shù)等細胞學效應的研究均也應作為選擇適宜輻射劑量的依據(jù)。本研究僅對無芒隱子草種子的萌發(fā)進行了研究，初步確定了最佳劑量，能否定向變異和選育尚無法得出結(jié)論，有待進一步深入研究。

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(責任編輯張瑾)

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0234

*收稿日期：2015-04-23接受日期：2015-07-08

基金項目：科技部“973”課題(2014CB138704);國家自然科學基金(31572453)

通信作者：張吉宇(1977-)，男，甘肅民樂人，副教授，博士，研究方向為草類作物育種與生物技術(shù)。E-mail:zhangjy@lzu.edu.cn

中圖分類號：S816;S335.3;Q945.34

文獻標識碼：A

文章編號：1001-0629(2016)3-0424-07* 1

Corresponding author：Zhang Ji-yuE-mail:zhangjy@lzu.edu.cn

Effect of colchicines and60Co-γ-rays on germination ofCleistogenessongoricaseeds

Zhang Dai-yu, Wu Fan, Zhang Ji-yu, Wang Yan-rong, Zhang Yan, Luo Dong

(State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China)

Abstract:This experiment systematically analyzed germination percentage, germination index and seedlings growth of Cleistogenes songorica with different doses of colchicine's and60Co-γ-rays treatments. The results showed that colchicine had certain degree of inhibition on seed germination of C. songorica. With the treatment of 0.1% colchicine solution for 48 h, the germination percentage and germination index were 54.3% and 43.3% of the control which were 41% and 0.55, respectively. However, the effects of60Co-γ-rays on germination percentage, germination index and the growth of seedlings varied with does. Low doses(50～200 Gy)increased germination percentage and germination index whereas high doses(400～2 000 Gy)inhibited the germination percentage, germination index and seedling growth. The germination percentage was 48.5% under the treatment of 600 Gy. The present study preliminary determined the semi-lethal dose treatment was 0.1% colchicine solution for 48 h and 600 Gy60Co-γ-rays, respectively, which provided a theoretical basis for the innovation of germplasm resources in C. songorica.

Key words:Cleistogenes songorica; colchicine;60Co-γ-rays; germination

張代玉,吳凡,張吉宇,王彥榮,張巖,羅棟.秋水仙素和60Co-γ射線對無芒隱子草種子萌發(fā)的影響.草業(yè)科學,2016,33(3)：424-430.

Zhang D Y,Wu F,Zhang J Y,Wang Y R,Zhang Y,Luo D.Effect of colchicines and60Co-γ-rays on germination ofCleistogenessongoricaseeds.Pratacultural Science，2016,33(3)：424-430.

植物生產(chǎn)層

第一作者：張代玉(1989-)女，甘肅靖遠人，在讀碩士生，研究方向為作物栽培與耕作學。E-mail:zhangdaiyu024@163.com