張婷許宏偉石志鴻紀(jì)勇

染色體9P21多態(tài)性與大動脈粥樣硬化型腦梗死的相關(guān)性☆

張婷*許宏偉△石志鴻*紀(jì)勇*

目的探討染色體9p21的rs7049105、rs647188、rs1333035位點與湖南長沙漢族人群大動脈粥樣硬化型腦梗死（large-artery atherosclerosis stroke，LAS）的相關(guān)性，并研究這3個位點在有頭頸部動脈粥樣硬化證據(jù)的人群中與LAS的相關(guān)性。方法收集湖南長沙漢族人群中229例LAS患者為病例組，同期門診及體檢中心“健康”人群中233例為對照組1，其中有動脈粥樣硬化證據(jù)的對照150例（64.38%）納入對照組2，無動脈粥樣硬化證據(jù)的對照83例（35.62%）納入對照組3。利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）方法對樣本進(jìn)行基因分型檢測。結(jié)果rs647188位點在湖南長沙漢族人群中可能不存在多態(tài)性；病例組與對照組1間、病例組與對照組3間rs7049105和rs1333035位點及病例組與對照組2間rs7049105位點的多態(tài)性分布比較未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。病例組與對照組2間rs1333035位點的基因型頻率分布比較發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=6.502，P= 0.039）。結(jié)論染色體9p21的rs10757274、rs7049105多態(tài)性與湖南長沙地區(qū)漢族人群LAS可能不相關(guān)，在湖南長沙漢族人群中rs647188位點可能不存在多態(tài)性，rs1333035位點多態(tài)性可能與啟動斑塊破裂及血栓栓塞相關(guān)。

9p21大動脈粥樣硬化型腦梗死 多態(tài)性

【Abstract】Objective To explore the association between rs7049105，rs647188，rs1333035 of chromosome 9p21 and the LAS among Chinese Han population of Changsha；to explore the association between rs7049105，rs647188，rs1333035 and the LAS among patients with evidence of cephalic and cervical vessel atherosclerosis.Methods The present study comprised 229 LAS patients and 233 healthy controls.The 233 controls which we defined control group 1.In the controls，150 （64.38%）controls with evidence of atherosclerosis were defined as control group 2，83（35.62%）controls without evidence of atherosclerosis were defined as control group 3.The sample genotyping was detected using MALDI-TOF-MS.Results There was no polymorphism of rs647188 among case group and control group 1.There was no significant difference in the polymorphism distribution of rs7049105 and rs1333035 between the case group and control group 1 and 3（P＞0.05）.There may be no significant different in the polymorphism distribution of rs7049105 between the case group and control group 2. The rs1333035 was associated with risk of LAS among patients with evidence of cephalic and cervical vessel atherosclerosis （χ2=6.502，P=0.039）.Conclusions The rs10757274 and rs7049105 polymorphism in the chromosome 9p21 may not be associated with risk of LAS among Han population of Changsha.There may be no polymorphism of rs647188 among Han populationof Changsha.The rs1333035polymorphism may be associatedwithplaque rupture andthrombosis.

【Key words】9p21 Large-artery atherosclerosis stroke Polymorphism

腦梗死是一種復(fù)雜的多基因疾病，發(fā)現(xiàn)疾病的致病基因或位點，可以為診斷及治療該病提供靶點。在染色體9p21中，9p21.3是到目前為止與冠心病相關(guān)性最為顯著的區(qū)域［1-3］。2012年METASTROKE協(xié)作組通過對多個GWAS進(jìn)行Meta分析驗證了9p21.3也與LAS存在相關(guān)性（p=3.32× 10-5）［4］，在9p21.3上游距離約80kb的一個區(qū)域有許多連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）的SNP位點，在一些研究中該區(qū)域被命名為1號單倍型區(qū)域［5-6］。2013年，F(xiàn)AN等［6］在4000多例高加索人樣本中驗證了9p21染色體1號單倍型與心肌梗死顯著相關(guān)。目前國內(nèi)外對于9p21的1號單倍型區(qū)域位點與LAS的相關(guān)性研究尚未見報道。故本研究擬在湖南長沙漢族人群中研究1號單倍型區(qū)域上下游共約36kb范圍內(nèi)的3個標(biāo)簽SNP（rs7049105、rs647188、rs1333035）與LAS的相關(guān)性。并通過參照Fan［6］的研究方法，在對照組中根據(jù)有無頭頸部動脈粥樣硬化證據(jù)進(jìn)行分組，在有頭頸部動脈粥樣硬化證據(jù)的人群中比較發(fā)生了LAS的患者與未發(fā)生LAS的患者間這3個位點的多態(tài)性分布，以期了解1號單倍型區(qū)域的SNP是否會提高有頭頸部動脈粥樣硬化證據(jù)的人群發(fā)生LAS的風(fēng)險。

1　對象與方法

1.1研究對象

1.1.1病例組選擇標(biāo)準(zhǔn) 收集2012年2月至2013 年12月期間湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的LAS患者229例為病例組，其中男125例，女104例，年齡從44歲～86歲，平均年齡（59.36±11.15）歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：①祖籍湖南長沙地區(qū)；②漢族人；③符合中國急性缺血性腦卒中診治指南2010中缺血性腦卒中的診斷［7］；④收集患者頸部血管彩超、經(jīng)顱多普勒超聲、磁共振血管造影（magnetic resonance angiography，MRA）、計算機斷層成像血管造影（computed tomography angiography，CTA）或數(shù)字減影血管造影 （digital subtraction angiography，DSA）報告提示存在頭頸部動脈粥樣硬化病變證據(jù)；⑤按照韓國改良-TOAST病因分型標(biāo)準(zhǔn)［8］納入LAS患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重心、肝、肺、腎功能不全患者；②心源性栓塞型；③小動脈閉塞型；④其他明確原因（如高凝狀態(tài)、血液系統(tǒng)疾病、血管炎、動脈夾層、煙霧病等）；⑤不明原因型（同時存在有多個導(dǎo)致中風(fēng)的因素，例如同時有大動脈粥樣硬化和心源性栓塞風(fēng)險；沒發(fā)現(xiàn)明顯的能導(dǎo)致中風(fēng)的病因?qū)W證據(jù)；由于不完善的檢查導(dǎo)致無法分類的卒中）。

1.1.2對照組選擇標(biāo)準(zhǔn) 對照組選自同期湘雅醫(yī)院門診及體檢中心的祖籍湖南長沙地區(qū)的“健康”漢族人群，共233例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①祖籍湖南長沙地區(qū)；②漢族人；③無神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史；④詢問收集每位入組者的頭頸部血管影像學(xué)資料，并且對無頭頸部血管影像學(xué)資料的患者行頸部血管彩超檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：有嚴(yán)重心、肝、肺、腎功能不全患者。

將對照組分為3組：對照組1：有或無頭頸部動脈粥樣硬化證據(jù)的對照，共233例；對照組2：從對照組1中篩選有頭頸部動脈粥樣硬化證據(jù)的對照，共150例；對照組3：從對照組1中篩選無頭頸部動脈粥樣硬化證據(jù)的對照，共83例。

所有受試者均經(jīng)知情同意，并經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)簽SNP（tagging SNP，tagSNP）的選擇 本研究采用HapMap CHB數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)來源為Hap-Map Data Rel 24/PhaseII，Nov08，on NCBI B36 assembly，dbSNP b126，運用Haploview軟件選擇tag SNP，在長度約11kb的1號單倍型（物理位置22019129-22031005）上下游各10kb的空間范圍（物理位置22004129-22041006，共36kb）內(nèi)篩選tagSNP，最終納入符合條件的rs7049105、rs647188、rs1333035位點。

1.2.2提取DNA及基因分型方法 采取受試者晨起空腹靜脈血5 mL，采用經(jīng)典的酚氯仿法提取基因組DNA，-20°分裝保存，由上海邃志生物科技有限公司采用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜方法（MALDI-TOF-MS）進(jìn)行基因分型。

1.2.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料比較用t檢驗，計數(shù)資料比較用χ2檢驗。采用Hardy-Weinberg平衡在線檢測（http：//ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl）對樣本進(jìn)行HWE檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1一般特點 總樣本量為462例，病例組和對照組1的一般特點見表1。兩組間在性別、年齡、吸煙史、飲酒史上無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而在BMI、高血壓、糖尿病病史這些方面有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

表1一般特點

2.2染色體9p21多態(tài)性研究

2.2.1 3個SNP位點的HWE檢驗 rs647188位點由于基因分型結(jié)果顯示其等位基因均為A，故不必進(jìn)行HWE檢驗。rs7049105、rs1333035均符合HWE平衡定律（P＞0.05）。

2.2.2病例組與對照組1的位點多態(tài)性分布比較rs7049105病例組分型成功228例樣本，對照組1分型成功232例樣本，基因型以GG型最為常見，等位基因以G最為常見；rs1333035病例組分型成功213例樣本，對照組1分型成功210例樣本；基因型以TT型最為常見，等位基因頻率以T最為常見。結(jié)果顯示：各個基因型及等位基因頻率分布在兩組間不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2.3病例組與對照組2的位點多態(tài)性分布比較本研究在對照組1中篩選出了1組有動脈粥樣硬化證據(jù)的對照組2。病例組加對照組2人群可以代表有頭頸部動脈粥樣硬化證據(jù)的人群。對照組2共有150例，rs704910、rs1333035位點分別分型成功150例、135例樣本。結(jié)果顯示：rs1333035位點的基因型頻率在病例組和對照組2間差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.039）（見表2）。

表2 rs7049105和rs1333035位點的多態(tài)性分布

2.2.4病例組與對照組3 rs7049105和rs1333035位點的多態(tài)性分布比較 對照組3為無動脈粥樣硬化型證據(jù)的人群，共有 83例，rs7049105、rs1333035位點分別分型成功82、75例樣本。結(jié)果顯示各個基因型及等位基因頻率分布在兩組間不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

3　討論

染色體9p21與常見的心血管病危險因素（如高血壓病、高血脂）缺乏關(guān)聯(lián)性，說明9p21有可能是通過某種全新的機制導(dǎo)致疾病的發(fā)生［9-10］，2010年，MUSUNURU等［5］作者發(fā)現(xiàn)染色體9p21與血小板聚集的增加存在相關(guān)性。而且該研究發(fā)現(xiàn)與血小板活性相關(guān)性最為顯著的SNP位于1號單倍型區(qū)域。1號單倍型區(qū)域的風(fēng)險等位基因可能通過調(diào)節(jié)血小板的活性增加了斑塊的易損及血栓栓塞，從而導(dǎo)致存在動脈粥樣硬化的人群發(fā)生心肌梗死與LAS。

在LAS中，常見的發(fā)病機制為原位動脈粥樣硬化血栓形成及動脈到動脈栓塞［11］，前文中提到1號單倍型可能與斑塊破裂及血栓栓塞相關(guān)，國內(nèi)有研究也發(fā)現(xiàn)某位點與腦梗死相關(guān)但并不與腦動脈狹窄相關(guān)，可能也是參與了斑塊破裂及血栓栓塞這一過程［12］。故在本次研究中，“原位動脈粥樣硬化血栓形成”在研究1號單倍型與LAS的相關(guān)性時便是一個混雜因素，因此我們通過設(shè)計對照組2，即有動脈粥樣硬化證據(jù)的對照組來匹配病例組與對照組，并增加了對照組樣本的同質(zhì)性，該實驗設(shè)計方法在REILLY［13］的研究中也有采用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在病例組與對照組2的基因型頻率比較中，rs1333035位點在兩組間具有統(tǒng)計學(xué)差別（P＜0.05）。rs1333035等位基因頻率比較未發(fā)現(xiàn)顯著差異，原因可能是某個核苷酸突變單獨存在時并不起作用，只有它處于純合或者雜合狀態(tài)時才與疾病相關(guān)［14］。

與對照組2比較的結(jié)論表明rs1333035位點與啟動斑塊破裂及血栓栓塞可能相關(guān)，與對照組3比較的結(jié)論表明rs1333035與頭頸部動脈粥樣硬化斑塊的存在及原位沉積可能并無相關(guān)性，而病例組與對照組1比較的結(jié)論并未發(fā)現(xiàn)rs1333035位點與LAS有相關(guān)性，但這正有可能是未匹配混雜因素而掩蓋了其相關(guān)性。

FAN等［6］的研究總樣本量達(dá)到4000多例，共在9p21檢測了24個位點，分別以單倍型的形式論證了9p21.3與冠心病顯著相關(guān)，1號單倍型與在心肌梗死的患者顯著相關(guān)。本研究的缺陷在于樣本量有限，且僅得到了單個位點的陽性結(jié)果，而在復(fù)雜性疾病的研究中，由多個變異位點所組成的單倍型分析比單個位點更有說服力。此外，在本次研究中rs1333035位點的基因分型成功率只有91.56%，這也成為了一個混雜因素。

綜上所述，rs647188可能在湖南長沙地區(qū)漢族人群中不存在多態(tài)性，rs7049105位點可能與LAS不具有相關(guān)性，rs1333035可能與啟動斑塊破裂及血栓栓塞有相關(guān)性，目前關(guān)于9p21對LAS的致病作用機制仍不明確，但很可能與影響血小板聚集相關(guān)，rs1333035位點與LAS的相關(guān)性研究在國內(nèi)外尚未見報告，故進(jìn)一步的大樣本量基因多態(tài)性研究及功能研究仍是十分必要的。

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（責(zé)任編輯：李立）

Association between chromosome 9p21 polymorphism and the large-artery atherosclerosis stroke.

ZHANG Ting，XU Hongwei，SHI Zhihong，JI Yong.HuanHu Hospital，Tianjin，300060，China.Tel：022-60367885.

R743

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.02.008
☆湖南省科技廳項目（編號：2013SK3030）
*天津市環(huán)湖醫(yī)院（天津 300060）
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2015-07-23）