程金生　韋卓恒　陳信炎　鄭啟祥　梁　香　歐陽小月

1.嘉應學院醫(yī)學院客家養(yǎng)生保健研究所，廣東　梅州　514031；2.廣東韶關學院生物醫(yī)藥實驗室，廣東　韶關　512005

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金花茶花朵總皂苷體外抗氧化實驗研究

程金生1,2韋卓恒1陳信炎1鄭啟祥1梁香1歐陽小月2

1.嘉應學院醫(yī)學院客家養(yǎng)生保健研究所，廣東梅州514031；2.廣東韶關學院生物醫(yī)藥實驗室，廣東韶關512005

【摘要】目的：研究金花茶花朵總皂苷活性成分的抗氧化活性。方法：以金花茶花朵為原料，以乙醇為提取介質，通過Amberlite XAD-4 非離子型大孔樹脂分離純化金花茶花朵中總皂苷，以維生素C(VitC)為對照品對金花茶花朵總皂苷進行抗氧化及還原能力實驗。結果：金花茶花朵總皂苷回收率為90.2%；羥基自由基清除能力、有機自由基清除能力、氧陰離子清除能力、亞硝酸根離子清除能力等實驗自由基清除率的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.75 mg/ml、0.05 mg/ml、0.26mg/ml； 還原能力試驗自由基清除率的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.83 mg/m。結論：金花茶花朵具有較好的抗氧化能力，是一種較好的天然自由基清除原料。

【關鍵詞】皂苷；金花茶；花朵；抗氧化活性

金花茶(CamellianitidissimaChi)在《中國植物志》[1]系統(tǒng)地定位為山茶科、山茶族、山茶屬。1933年中國山茶科植物研究專家、中山大學張宏達教授在景烈采到第一株金黃色山茶花標本。1960年，廣西藥物研究所學者在廣西十萬大山采集標本時發(fā)現(xiàn)大面積金黃色茶花，并正式命名為金花茶[2]。金花茶是我國一級重點珍稀保護植物，有著“植物界大熊貓”之美稱。其葉和花等部位除富含茶多酚、β-谷甾醇、總黃酮、多種氨基酸、齊墩果酸、可溶性糖、天然維生素E等天然活性成分外，皂苷也是其主要活性成分之一[3-4]。一些研究者開展了金花茶皂苷類活性成分的提取分離及相關活性研究。如蘇琳等利用超聲提取、大孔樹脂富集以及制備色譜等技術對金花茶葉水溶性部分進行分離純化，得到3個單體化合物，運用核磁共振、質譜、紅外等表征手段進行結構鑒定，確定分別為人參皂苷Rg1、人參皂苷F1和人參皂苷F5等[5]。黃艷等由金花茶分離得到了一種達瑪烷皂苷類新化合物，新化合物被命名為(3β,6α,12β)-3,6,12-三羥基達瑪烷-24-烯-20-甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。作者采用CCk-8法對該化合物進行了抗腫瘤活性實驗，結果顯示該化合物可以有效抑制人肺癌BeL-7402細胞和人肝癌SMMC-7721細胞的生長[6]。

隨著長壽及養(yǎng)生產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，人們對天然、無毒的抗氧化劑需求日益增大。金花茶作為衛(wèi)生部批準的新資源食品之一，皂苷活性成分豐富，并開展了金花茶葉中皂苷抗氧化的相關研究[7]。研究以金花茶花朵為原料，通過乙醇提取及Amberlite XAD-4 非離子型大孔樹脂純化，得到純化后的金花茶花朵總皂苷，并開展金花茶總皂苷抗基自由基(·OH)、抗二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)、抗超氧陰離子(O2-·)自由基、抗亞硝酸鹽(NO2-)等抗氧化實驗及還原能力實驗研究。

1儀器、材料與方法

1.1儀器FA-A/JA-N 電子天平(海民橋精密科學儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠)；旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；TU-1901雙光束可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；KQ3200E型超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)；GL-25M離心機(上海趙迪生物科技有限公司)；電子天平(上海實干實業(yè)有限公司)；Wi94186恒溫水浴箱(北京東西儀科技有限公司)。

1.2材料金花茶花朵等原料由廣東盛世通生物有限公司提供。Amberlite XAD-4非離子型大孔樹脂(阿拉丁試劑(上海)有限公司)，人參皂苷Rb1(上海生工)。所用試劑均為分析純，購于廣州化學試劑有限公司。金花茶花朵總皂苷提取液為自制。

1.3提取或檢測方法

1.3.1金花茶花朵優(yōu)選及花朵中總皂苷分離純化采摘秋季新鮮的金花茶花朵，采用電子秤稱重；對采摘的新鮮金花茶花朵按照《中華人民共和國藥典》(2010年版)要求進行優(yōu)選，除去質量較差花朵，優(yōu)選出的金花茶花朵原料必須符合無霉變、無異味、無雜質等藥典要求；將優(yōu)選出金花茶花朵洗凈后，真空干燥得金花茶花朵干品。

取上述干品300 g，用多功能粉碎機粉碎，過30目篩，隨后加入1.5 L 95%乙醇，置于超聲清洗儀(90 kHz)超聲提取30min，合并3次提取液，采用旋轉蒸發(fā)儀除去乙醇，加水至200ml，加石油醚250ml萃取，重復兩次，留水層；再用等體積正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，旋轉蒸發(fā)儀回收正丁醇，得金花茶花朵總皂苷浸膏。該浸膏用甲醇定容在100ml容量瓶中，即得待測樣品溶液，備用。精密吸取待測溶液0.1ml于試管中，水浴揮干甲醇，依次加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，于60℃水浴加熱15min，隨后冰浴冷卻5min，加冰醋酸5ml搖勻，以試劑為空白對照，產(chǎn)物在560nm處測定吸收值，計算樣品溶液中金花茶皂苷含量：金花茶皂苷含量=樣品溶液中皂苷含量(mg)/樣品質量(g)。

參考并改進文獻方法[8]，采用Amberlite XAD-4非離子型大孔樹脂(洗脫劑：10%、20%、30%異丙醇)，原液上樣(質量濃度24.42mg/ml，pH 4.8)，上樣流速為1.20 BV/h，洗脫過程首先用1.25 BV，蒸餾水除雜，再依次用1.75 BV和2 BV對金花茶花朵總皂苷提取液進行分離除雜，得到較純金花茶花朵總皂苷，供后續(xù)抗氧化實驗使用。

1.3.2檢測方法

1.3.2.1金花茶花朵中總皂苷含量測定采用香草醛-硫酸法測定，以人參皂苷Rb1為標準物質，作標準曲線，并計算樣品中皂苷的含量。人參皂苷Rb1對照品經(jīng)香草醛-高氯酸顯色后于TU-1901雙光束可見分光光度計上作最佳吸收波長掃描，并繪制掃描曲線，顯色后，反應物在560nm處有最大吸收且2 h內吸光度保持穩(wěn)定。

1.3.2.2標準曲線的繪制精密吸取人參皂苷Rb1標準品溶液1ml(濃度分別為：0.1、0.08、0.05、0.02、0.01mg/ml)于試管中，水浴揮干甲醇，加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，于60℃水浴加熱15min，隨后水中低溫冷卻5min，加冰醋酸5ml搖勻，以實際空白對照，反應產(chǎn)物在560nm處測定吸收值，以人參皂苷Rb1為對照品繪制測定標準曲線[9]。

1.4體外抗氧化實驗

1.4.1金花茶花朵總皂苷對羥基自由基(·OH)清除能力的測定

1.4.1.1實驗原理羥基自由基(·OH)是體內最活潑的活性氧，具有極強的氧化能力。該實驗方法采用芬頓體系，在各自的吸收范圍內測定吸光度值的變化，可得到受試抗氧化劑清除·OH的情況。

1.4.1.2實驗方法在試管中加入4.5ml pH=7.4的磷酸緩沖溶液，1.5ml 1.5 mmol/l的鄰二氮菲溶液，充分混勻，加入1ml 1.5 mmol/l FeSO4溶液，立即混勻，加入1ml維生素C標準液標準液(0.25mg/ml)，金花茶待測液的濃度依次為0.5、0.75、1、1.5mg/ml。分別混勻，再加入1ml 0.02%H2O2，同時做樣品空白試驗。另做損傷管和未損傷管，其中損傷管中加入1ml 0.02%H2O2與1ml的蒸餾水，未損傷管不加H2O2，直接加入2ml蒸餾水(損傷管與未損傷管用磷酸緩沖液調零)。于37℃保溫60min，510nm處測A值，重復2次，羥基自由基的清除率按照下式計算：

1.4.2金花茶花朵總皂苷對有機自由基DPPH·清除能力的測定

1.4.2.1實驗原理DPPH·(1,1-二苯基苦基苯肼)是一種人工合成的自由基。該物質在517nm有強烈的吸收峰，其乙醇水溶液呈深紫色，加入受試物后，測定在同一時間內不同濃度抗氧化劑對DPPH·吸光度的影響，反映其抗氧化能力的強弱。

1.4.2.2實驗方法取不同濃度的各試樣液4ml于試管中(其中維生素C標準液和金花茶待測液的濃度依次為0.01、0.05、0.25、0.5、1.0mg/ml)，再加入4ml DPPH·的乙醇溶液(濃度為200 μmol/l)，混合均勻，避光保存0.5 h后用分光光度計在517nm處測定其吸光度A1：同時測4ml DPPH·溶液+4ml 乙醇混合后的吸光度A，對照和4ml提取液加4ml乙醇混合后的吸光度A樣品空白，重復2次，按下式計算各試樣對DPPH·的清除率：

1.4.3金花茶花朵總皂苷對超氧陰離子(O2-·)清除能力的測定

1.4.3.1實驗原理實驗通過用過氧化物酶(如辣根過氧化物酶)催化東莨菪原被H2O2氧化生成非熒光產(chǎn)物。將受試物加入該反應體系，檢測非熒光物質的生成情況，以了解受試物同H2O2反應的情況。

1.4.3.2實驗方法取6支具塞試管，分別加入4.5ml pH=8.2 Tris-HCl緩沖溶液和1ml不同濃度的各試樣液(其中維生素C標準液和金花茶待測液的濃度依次為0.01、0.03、0.05、0.1、0.3mg/ml)。置于25℃水浴中保溫25min，隨后加入25℃下預熱的0.3ml鄰苯三酚(3 mmol/l)啟動反應，在30s 內加入5ml蒸餾水，最后在25℃水浴下繼續(xù)反應4min，立即滴加0.5ml 濃度為8 mol/l 的HCl終止反應。在325nm波長處測定吸光度。同時設置對照管，對照管以緩沖溶液調零。加藥管則分別以相同濃度樣品液調零實，重復2次，按下式計算超氧陰離子的清除率：

1.4.4金花茶花朵總皂苷對亞硝酸根離子(NO2-)清除能力的測定1.4.4.1實驗原理在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化，再與鹽酸萘7-胺偶合形成紫紅色染料，其最大吸收波長在538nm，能夠清除亞硝酸鹽(NO2-)的物質可使紫紅色染料538nm的吸光度值減弱，因此可通過測定在538nm的吸光度值間接反應受試物清除亞硝酸鹽(NO2-)的能力。

1.4.4.2實驗方法NaNO2標準曲線的繪制 配制10、7.5、l、2.5、1μg/ml的NaNO2溶液，在538nm波長處測定吸光度，繪制曲線。用移液管精確吸取亞硝酸鈉標準液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5ml于一組50ml容量瓶中，各加水至25ml，分別加入2ml 0.4%對氨基苯磺酸溶液，搖勻。靜置3到5min后加入1ml 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，并用重蒸水定容到50ml，搖勻，靜置15min后，用分光光度計在540nm波長下測定吸光度，以蒸餾水為空白。以測得的各比色液的吸光度對應的亞硝酸濃度作曲線。比色液中亞硝酸鈉濃度為0～0.3μg/ml時，兩者呈直線關系。

對亞硝酸根離子(NO2-)清除能力的測定：取1ml不同濃度的各試樣液于10ml比色管中(其中維生素C標準液與金花茶待測液的濃度依次為0.1、0.5、1 、3、5mg/ml)。加入5μg/ml的NaNO2標準溶液0.5ml，在37℃恒溫水浴中反應30min 。取出后立即加入1ml 0.4%的對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置5min后加入0.5ml 0.2%的鹽酸荼乙二胺溶液，加水至l0ml刻度，混勻，靜置15min，以不加NaN02和樣品溶液的試劑為空白，于538nm處測定吸光值。通過NaNO2標準曲線得到相應的NaNO2含量。重復兩次，按下式計算其平均值。

1.4.5金花茶花朵總皂苷還原能力的測定

1.4.5.1實驗原理還原能力的測定是以待測樣是否為一良好的電子供應者為評價。若是其供應的電子除可以使Fe3+還原成Fe2+外，還可與自由基結合成惰性的物質，中斷自氧化鏈鎖反應，可認為是良好的電子供應者。

1.4.5.2實驗方法在2.5ml pH=6.6的磷酸鹽緩沖液中加入不同濃度的各試樣液2.5ml(其中維生素C標準液與金花茶待測液的濃度依次為0.01、0.03、0.05、0.1、0.3mg/ml)和1%的鐵氰化鉀溶液2.5ml，混合物在50℃下恒溫20min后，再加入2.5ml 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000 r/min離心分離10min，取上層清液5ml，加蒸餾水5ml和0.1%FeCl3溶液1ml，在700nm處測定吸光度，吸光度越高，還原能力越強。

2結果與分析

2.1金花茶花朵中總皂苷分離純化及含量測定采用香草醛-硫酸法測定，以人參皂苷Rb1為標準物質，以實際空白對照，溶液經(jīng)香草醛-高氯酸顯色后于雙光束可見分光光度計上作最佳吸收波長掃描，作標準曲線，并計算樣品中皂苷的含量，結果見表1。人參皂苷Rb1對照品濃度范圍為0.001～0.01mg/ml。

上樣前金花茶花朵粗皂苷濃度為69.9mg/ml，經(jīng)過Amberlite XAD-4 非離子型大孔樹脂吸附，梯度濃度的異丙醇洗脫后，得到洗出液。當繼續(xù)濃縮到與上樣液等體積時，粗皂苷溶液濃度為63.1mg/ml，皂苷回收率為90.2%。上述實驗結果證明XAD-4非離子型大孔樹脂有較好的分離純化金花茶花朵中總皂苷的能力。這主要源于皂苷為中等極性物質，根據(jù)相似相溶原理，較易溶于極性較大的溶劑。實驗顯示，金花茶花朵總皂苷在95%乙醇中的溶解度比在水或無水甲醇中的溶解度更大(見表2)。基于此，下述實驗均采用95%乙醇為提取介質分離純化金花茶花朵中總皂苷供后續(xù)抗氧化實驗使用。

表1　不同濃度人參皂苷Rb1的吸光度

表2　不同方法金花茶花朵中總皂苷的提取率

2.2總皂苷對羥基自由基(·OH)清除能力的測定由圖1可知，金花茶花朵中總皂苷和維生素C對對羥基自由的清除率與濃度呈正相關關系，二者有劑量依賴性，且清除率隨濃度的增大而提升。金花茶花朵總皂苷濃度介于0.25mg/ml～1.52mg/ml之間時，其清除率均稍低于維生素C標準品的清除率。當金花茶花朵總皂苷濃度達到1.52mg/ml時，兩者清除率均達到了峰值，且二者的清除率基本相等。表明金花茶花朵總皂苷對對羥基自由基有較好的清除能力，且濃度在1.52mg/ml時清除率達到峰值，高達100%。此外，當金花茶花朵總皂苷濃度范圍在0.5～1.0mg/ml時，其對羥基自由基的清除率率線性良好，IC50為0.75mg/ml。

2.3總皂苷對有機自由基DPPH·清除能力的測定以吸光度A值為縱坐標，以自由基DPPH·濃度(μmol/ml)為橫坐標，作標準曲線。得回歸方程：Y=0.0070X+0.0256，R2=0.9998(Y：吸光度；X：DPPH·濃度)，其線性范圍為40～200 μmol/ml。見圖2。

由圖3可知，VitC標準品與金花茶花朵總皂苷對DPPH·的清除率均隨濃度的增加而增加，金花茶花朵總皂苷對DPPH·的清除率與濃度基本呈線性關系。在較低濃度下，金花茶花朵總皂苷對DPPH·已有較強的清除能力。在0.01～0.25mg/ml濃度范圍時，金花茶花朵總皂苷清除率亦有較好的線性關系，IC50為0.05mg/ml。當金花茶花朵總皂苷在0.07mg/ml時，其對DPPH·自由基的清除率為85.2%，與VitC標準品對DPPH·自由基的清除率數(shù)據(jù)實現(xiàn)交叉。當金花茶花朵總皂苷大于0.07mg/ml時，其對DPPH·自由基的清除率均高于VitC標準品對應的清除率，充分展現(xiàn)了金花茶花朵總皂苷在清除有機自由基DPPH·方面的優(yōu)勢。

2.4總皂苷對超氧陰離子(O2-·)清除能力的測定由圖4可知，金花茶花朵總皂苷、VitC對超氧陰離子(O2-·)有一定的清除能力，并且清除能力隨著濃度的增大而提升。當濃度低于0.1mg/ml時，金花茶花朵總皂苷的清除能力比等同濃度下VitC清除能力強。當金花茶花朵總皂苷濃度大于0.1mg/ml，其對超氧陰離子(O2-·)的清除率反而低于同濃度下VitC對超氧陰離子(O2-·)的清除率。當二者濃度均為0.3mg/ml時，金花茶花朵總皂苷清除率為60.9%，低于VitC清除率(81.2%)。表明在低濃度下金花茶花朵總皂苷才具有優(yōu)于VitC標準品的超氧陰離子(O2-·)清除效率，金花茶花朵總皂苷IC50為0.26mg/ml。

2.5總皂苷對亞硝酸根離子(NO2-)清除能力的測定為衡量金花茶花朵總皂苷對亞硝酸根離子(NO2-)清除能力，以吸光度A值為縱坐標，亞硝酸鈉濃度(μg/ml)為橫坐標，得回歸方程式為：Y=0.5041X+0.0012，R2=0.9914(Y：吸光度；X：亞硝酸鈉濃度)，其線性范圍為0.06 μg/ml～0.63 μg/ml。見圖5。

由圖6可知，VitC與金花茶花朵總皂苷對亞硝酸根的清除率均隨濃度的增大而升高。當金花茶花朵總皂苷濃度小于1mg/ml時，其清除效果略微強于VitC。當金花茶花朵總皂苷濃度達到1mg/ml時，其清除率達到了53.6%以上，與VitC清除率相等。在1.0mg/ml～5.0mg/ml范圍內，金花茶花朵總皂苷對亞硝酸根清除率僅有微幅提示，提升幅度顯著弱于等濃度下VitC標準品。表明金花茶花朵總皂苷對亞硝酸鈉的清除能力僅在低濃度下具有相對VitC標準品略優(yōu)的清除率，其IC50為0.83mg/ml。

2.6金花茶總皂苷還原能力的測定[10-11]維生素C與金花茶花朵總皂苷具有良好的還原能力，是良好的電子供應者，其供應的電子除可以使Fe3+還原成Fe2+外，還可以與自由基成為較惰性的物質，從而中斷自氧化連鎖反應。由圖7可知，在700nm處測定吸光度，吸光度越高，則還原能力越強。但低濃度下，金花茶花朵總皂苷還原能力有限，如當其濃度在0.01mg/ml時，其吸光度值接近0。而當金花茶花朵總皂苷濃度為0.03mg/ml時，其吸光度值大幅升高到37.1%。當金花茶花朵總皂苷濃度范圍在0.03mg/ml-0.05mg/ml范圍時，其還原能力(A值)僅有小幅提升。在所有濃度范圍內，金花茶花朵總皂苷還原能力均顯著低于維生素C。表明在還原能力方面，金花茶花朵總皂苷并不具優(yōu)勢。

3結論

研究采用乙醇為提取介質對金花茶花朵中總皂苷進行提取，通過Amberlite XAD-4 非離子型大孔樹脂分離純化金花茶皂苷，回收率為90.2%。以維生素C為對照品對金花茶花朵中總皂苷進行了羥基自由基清除能力、有機自由基清除能力、氧陰離子清除能力、亞硝酸根離子清除能力等四種抗氧化實驗及還原能力實驗，不同自由基的四種抗氧化實驗均有一定的抗氧化能力，四種抗氧化實驗自由基清除率半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.75、0.05、0.26、0.83mg/ml。在還原能力方面，金花茶花朵中總皂苷弱于同濃度下維生素C。表明金花茶是一種較好的天然自由基清除原料，有望作為食品工業(yè)、日用化學品工業(yè)的天然抗氧化劑，具有深一步的研究與開發(fā)意義。

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基金項目：廣東生揚帆計劃引進緊缺拔尖人才項目(粵人才[2015]9號)、廣東公益研究與能力建設項目(2015A010105034)、廣東省醫(yī)學科學基金(A2015518)。

作者簡介：程金生(1976-)，男，江西鄱陽人，博士，副教授，主要從事食品分析、藥物分析研究。E-mail:chengjins@gmail.com

【中圖分類號】R285.5

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)10-0027-04

(收稿日期：2016.03.23)

In vitro Antioxidant Experiment Research of Total Saponins in the Flower of Camellia nitidissima Chi

CHENG Jinsheng1,2WEI Zuoheng1CHEN Xinyan1ZHENG Qixiang1LIANG Xiang1OUYANG Xiaoyue2

1.Institute of Hakka Health Care, School of Medicine, Jiaying University,Meizhou 514021, China;2. Biomedical Laboratory, Shaoguan University,Shaoguan 512005,China

Abstract:Objective to study the antioxdidant activity of the total saponins in the flower of Camellia nitidissima Chi. Method By starting from dry flowers of Camellia nitidissima Chi, the ingredients of saponins were extracted by 95% of ethanol. Successively, the saponins extraction was purified by macroporous resin of Amberlite XAD-4. Meanwhile, five series antioxidant experiments VS VitC had been conducted on the saponins extraction of Camellia nitidissima Chi. Results the recovery rate of the extraction and purification experments was 90.2%. Antioxidant experiments and reduction ability experiment were conducted in this work: 1) The hydroxyl radical scavenging capacity; 2) organic radical scavenging capacity; 3) oxygenanion removal ability; 4) the nitrite ion removal ability; 5) reducing abilities experiment. Investigations showed that half of the inhibition of IC50 of the first four clearance rate tests are 0.75 mg/ml, 0.05mg/ml, 0.26mg/ml and 0.83 mg/ml, respectively.Conclusion Camellia nitidissima Chi flower is excellent natural antioxidants with superior antioxidant performance.

Key words:Saponins; Camellia nitidissima Chi, Flower; Antioxidant activitity