劉俊江，李守賓，李瑾宜，馮啟紅，王　剛，魏　東，孫振福，楊　濤，張?zhí)N霞

(1．河北省人民醫(yī)院泌尿外科， 河北石家莊　050051；2．開灤總醫(yī)院泌尿外科， 河北唐山　063000；3．西奈山醫(yī)院， 美國紐約；4．河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科， 河北石家莊　050051)

?

·臨床研究·

叢生蛋白在腎遠(yuǎn)曲小管的表達(dá)及其與腎結(jié)石關(guān)系的初步研究

劉俊江1，李守賓2，李瑾宜3，馮啟紅2，王剛1，魏東1，孫振福1，楊濤1，張?zhí)N霞4

(1．河北省人民醫(yī)院泌尿外科， 河北石家莊050051；2．開灤總醫(yī)院泌尿外科， 河北唐山063000；3．西奈山醫(yī)院， 美國紐約；4．河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科， 河北石家莊050051)

摘要：目的探討Clusterin在腎臟遠(yuǎn)曲小管的表達(dá)與腎結(jié)石的關(guān)系。方法用免疫組化方法檢測(cè)腎結(jié)石患者及對(duì)照組腎臟組織切片中clusterin表達(dá)情況，并作比較分析。結(jié)果Clusterin在腎結(jié)石組及對(duì)照組腎遠(yuǎn)曲小管均有陽性表達(dá)，45例腎結(jié)石組患者平均表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分為190.73±80.00，38例對(duì)照組為97.76± 63.57，腎結(jié)石組表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P<0.001)。結(jié)論clusterin表達(dá)于腎遠(yuǎn)曲小管，在腎結(jié)石患者中表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示腎遠(yuǎn)曲小管損傷與腎結(jié)石的形成有關(guān)。

關(guān)鍵詞：腎結(jié)石；結(jié)石形成；從生蛋白；腎遠(yuǎn)曲小管；免疫組化

腎結(jié)石是泌尿外科最常見的疾病之一，但是泌尿系結(jié)石的發(fā)生機(jī)制仍不十分明確，關(guān)于腎結(jié)石形成起源部位也存在爭(zhēng)議。叢生蛋白(Clusterin)是一種廣泛存在于人體組織和體液中的凋亡相關(guān)蛋白，參與多種生理過程，在很多腎臟損害模型中表達(dá)明顯升高，且早于肌酐的變化[1]。腎結(jié)石的發(fā)生也伴隨著腎小管上皮損傷等病理過程，Clusterin是否參與腎結(jié)石的發(fā)生過程，目前尚無相關(guān)研究，為了探討Clusterin與腎結(jié)石發(fā)生的關(guān)系，我們檢測(cè)了腎結(jié)石患者和非泌尿系結(jié)石患者腎組織中Clusterin的表達(dá)，并做比較分析。

1資料與方法

1.1臨床資料經(jīng)河北省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)討論同意，選擇2013年12月至2014年12月在河北省人民醫(yī)院泌尿外科接受經(jīng)皮腎鏡手術(shù)治療的腎結(jié)石患者45例,年齡23～58歲，平均(42.89±8.49)歲；男性31例，女性14例；在接受手術(shù)前，在超聲引導(dǎo)下行腎臟組織穿刺活檢，活檢組織制成石蠟切片。選取在河北省人民醫(yī)院因外傷行腎切除的患者作為對(duì)照組，共38例，年齡21～53歲，平均(40.68±8.68)歲；男性28例，女性10例；所有入選患者需排除惡性腫瘤、高鈣血癥、高尿酸血癥、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、痛風(fēng)、腎小管酸中毒、髓質(zhì)海綿腎、維生素D中毒等疾病，無腎積水及腎功能異常，無泌尿系感染。兩組患者性別比例、年齡無顯著性差異(P>0.05)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 將4 μm 組織切片進(jìn)行脫蠟和水化,浸入3%H2O2溶液中，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，10% 檸檬酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，Clusterin單克隆抗體在4℃下孵化過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖液洗滌3次后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的葡聚糖聚合物偶聯(lián)抗-鼠抗體室溫下孵化30 min，3次洗滌后，切片用二氨基聯(lián)苯胺處理，用蘇木精染色。用同一石蠟切塊的切片，不用抗體孵化，作為空白對(duì)照，用腎細(xì)胞癌切片作為陽性對(duì)照，胞質(zhì)深染視為陽性。切片由3位互不知情的病理醫(yī)師分別檢查2次，用高倍顯微鏡觀察，400倍高倍鏡下觀察至少5個(gè)視野，每個(gè)區(qū)域至少評(píng)估500個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)<1%為陰性，陽性細(xì)胞≥1%為陽性。表達(dá)強(qiáng)度用半定量方法測(cè)量：陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分(淺染色計(jì)1分,中等染色計(jì)2分,深染色計(jì)3分)乘以陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)做出評(píng)分，取平均值[2]。設(shè)定評(píng)分<150分為弱表達(dá)，評(píng)分≥150分為強(qiáng)表達(dá)。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，且以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Clusterin在腎遠(yuǎn)曲小管的表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)clusterin在腎遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞有陽性表達(dá)，兩組間表達(dá)強(qiáng)度不同(圖1):結(jié)石組強(qiáng)表達(dá)率及評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P<0.001, 表1)。

圖1　Clusterin在腎遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2.2性別與Clusterin表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)系病例組織切片Clusterin染色評(píng)分男性平均為143.97±82.67，女性為158.50±95.37，性別間無顯著性差異(P=0.489)。

表1臨床基本資料及兩組間clusterin染色評(píng)分結(jié)果

項(xiàng)目腎結(jié)石組對(duì)照組t/χ2值P值例數(shù)4538年齡(x±s,歲)42.89±8.4940.68±8.68 1.1670.247男性[例(%)]31(68.89)28(73.68)0.2300.631Clusterin染色評(píng)分(x±s,分)190.73±80.0097.76±63.575.7840.000clusterin強(qiáng)表達(dá)[例(%)]30(66.7)10(35.7)13.4350.000

3討論

Clusterin是由FRITZ等于1983年鑒定并命名，研究發(fā)現(xiàn)Clusterin參與多種重要的生理過程包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞粘附、組織修復(fù)等，并與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切[3]。Clusterin也參與多種腎臟疾病過程，ISHIII等發(fā)現(xiàn)在腎積水模型大鼠中Clusterin mRNA水平升高60倍，通過免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Clusterin表達(dá)位于腎遠(yuǎn)曲小管[4]。JUNG[5]等通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及單側(cè)腎積水模型研究，發(fā)現(xiàn)Clusterin可起到保護(hù)腎臟、延緩纖維化的作用，認(rèn)為Clusterin表達(dá)上升是對(duì)損傷的一種保護(hù)性反應(yīng)而非導(dǎo)致?lián)p傷的原因[5]。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)，Clusterin表達(dá)的升高能更靈敏地反應(yīng)腎臟損傷，且已經(jīng)被批準(zhǔn)作為預(yù)測(cè)腎臟早期損害的標(biāo)記物[8]，因此，如果腎組織中Clusterin表達(dá)升高，提示存在損傷。

腎結(jié)石的發(fā)生機(jī)制目前尚不清楚，自從RANDALL在1937年發(fā)現(xiàn)腎乳頭上皮組織下有一種鈣化斑塊，并稱之為Randall斑，Randall斑被很多人認(rèn)為是腎結(jié)石的起源。但是該學(xué)說一直存在爭(zhēng)議，EVAN等[9]在草酸鈣結(jié)石患者髓袢細(xì)支的上皮基底膜表面發(fā)現(xiàn)結(jié)晶，并發(fā)現(xiàn)有環(huán)狀蛋白物質(zhì)沉積。在接受胃腸旁路手術(shù)的患者中，集合管起始部尿路上皮間可發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)狀沉積物，而不是Randall斑。說明在結(jié)石形成過程中，基底膜及腎小管上皮可能起到重要作用[9-10]。BAGGA等[6]認(rèn)為高滲透壓可能造成腎小管上皮的損傷，暴露基底膜，導(dǎo)致結(jié)晶的形成和發(fā)展。KHAN[7]認(rèn)為結(jié)晶和細(xì)胞的相互作用是結(jié)石發(fā)生的重要因素，結(jié)晶可以導(dǎo)致腎小管上皮的損傷，腎小管的損傷會(huì)促進(jìn)結(jié)晶的滯留及在腎乳頭表面形成結(jié)石。說明腎小管損傷才是結(jié)石形成的關(guān)鍵因素。

本研究發(fā)現(xiàn)Clusterin在腎遠(yuǎn)曲小管中表達(dá)，與國外文獻(xiàn)報(bào)道一致，且在腎結(jié)石患者中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，證實(shí)了腎結(jié)石的發(fā)生與腎小管細(xì)胞的損傷相關(guān)，也說明腎遠(yuǎn)曲小管可能是結(jié)石形成的初始部位，為進(jìn)一步研究腎結(jié)石形成機(jī)制提供了一定的基礎(chǔ)。且由于腎結(jié)石患者Clusterin表達(dá)明顯增強(qiáng)，檢測(cè)尿液Clusterin的水平有可能可以作為腎結(jié)石的早期診斷指標(biāo)，具有一定的應(yīng)用前景。

但Clusterin表達(dá)的升高是結(jié)石形成后損傷腎小管上皮細(xì)胞的結(jié)果還是參與了結(jié)石形成的過程，比如促進(jìn)結(jié)晶與腎小管的粘附，本研究尚不能完全解釋，需要進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] PETRA V, SOFIE S, ERIO B T,et al. Tissue Kim-1 and urinary clusterin as early indicators of cisplatin-induced acute kidney injury in rats[J].Toxicol Pathol, 2012,40:1049-1062.

[2] LI JY, ZHOU T, GAO X, et al. Testosterone and androgen receptor in human nephrolithiasis[J]. J Urol,2010,184:2360-2363.

[3] SHANNAN B, SEIFERT M, LESKOV K，et al. Challenge and promise:roles for clusterin in pathogenesis, progression and therapy of cancer[J]. Cell Death Differ, 2006,13(1):12.

[4] ISHII A, SAKAI Y, NAKAMURA A .Molecular pathological evaluation of clusterin in a rat model of unilateral ureteral obstruction as a possible biomarker of nephrotoxicity[J]. Toxicol Pathol,2007，35:376-382.

[5] JUNG GS, KIM MK, JUNG YA, et al. Clusterin attenuates the development of renal fibrosis[J]. J Am Soc Nephrol,2012,23:73-85.

[6] BAGGA HS1, CHI T, MILLER J, et al. New insights into the pathogenesis of renal calculi [J].Urol Clin North Am,2013,40:1-12.

[7] KHAN SR. Renal tubular damage/dysfunction: key to the formation of kidney stones[J]. Urol Res,2006,34:86-91.

[8] DAVID ABROTT, SCOTT HADLER, RAMIN ARANI, et al.Characterization of renal biomarkers for use in clinical trials: biomarker evaluation in healthy volunteers[J]. Drug Des, Dev Thera, 2014,8: 227-237.

[9] EVAN AP, COE FL, RITTLING SR, et al. Apatite plaque particles in inner medulla of kidneys of calcium oxalate stone formers: osteopontin localization[J]. Kidney Int,2005,68:145-154.

[10] EVAN AP, BLEDSOE S, WORCESTER EM, et al. Renal inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 3 increases in calcium oxalate stone-forming patients[J]. Kidney Int,2007, 72:1503-1511.

(編輯何宏靈)

收稿日期：2015-05-31修回日期：2015-09-26

基金項(xiàng)目：河北省科技廳指令性計(jì)劃(No.14277774D)

通訊作者：張?zhí)N霞，主任醫(yī)師.E-mail：Zhangyunxia67@163.com

作者簡(jiǎn)介:劉俊江(1967-)，男(漢族)，碩士，主任醫(yī)師.研究方向：泌尿系結(jié)石.E-mail：liujunjiang67@163.com

中圖分類號(hào):R692.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.01.007

A preliminary study of the relationship between clusterin expression in renal distal tubule and kidney stone formation

LIU Jun-jiang1, LI Shou-bin2, LI Jin-yi3,FENG Qi-hong2,WANG Gang1, WEI Dong1, SUN Zhen-fu1, YANG Tao1, ZHANG Yun-xia4

(1.Department of Urology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051,China; 2.Department of Urology, Kailuan General Hospital, Tangshan 063000, China; 3.Mount Sinai Hospital, New York, USA; 4.Department of Obstetrics and Gynecology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the relation between clusterin expression in renal distal tubule and kidney stones. MethodsThe clusterin expression in renal tissues was detected with immunohistochemical assays in patients with kidney stones and controls. ResultsPositive expressions were detected in both nephrolithiasis group and controls. The mean clusterin score in nephrolithiasis and control samples was 190.73±80.00 and 97.76±63.57, respectively. Patients with kidney stones had a significantly higher mean clusterin score than controls (P<0.001). ConclusionClusterin expression can be detected in renal distal tubule, and the expression intensity in nephrolithiasis group is significantly higher than in controls, which indicates the injury in renal distal tubule is related to kidney stone formation.

KEY WORDS:nephrolithiasis; calculogenesis; clusterin; renal distal tubule; immunohistochemistry