廉建坡，陳東寧，?！∮?，徐烈雨，張翀宇，芮文斌，吳瑜璇，沈周俊，寧　光

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科，上海　200025)

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·基礎(chǔ)研究·

Ganetespib對PC12細(xì)胞的凋亡及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

廉建坡，陳東寧，祝宇，徐烈雨，張翀宇，芮文斌，吳瑜璇，沈周俊，寧光

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科，上海200025)

摘要：目的體外探討熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)抑制劑Ganetespib對PC12細(xì)胞生長的影響及血管內(nèi)皮生長因子VEGF表達(dá)的調(diào)控。方法應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)比色法觀察Ganetespib對大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12細(xì)胞的生長抑制作用；流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)觀察不同濃度Ganetespib處理細(xì)胞后的細(xì)胞周期變化；蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting法)檢測HSP90、VEGF蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果Ganetespib呈時(shí)間、劑量依賴性抑制PC12細(xì)胞，24 h半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.2 μmol/L；Ganetespib在0.2 μmol/L濃度能夠有效引起PC12細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期；Ganetespib能抑制PC12細(xì)胞的HSP90、VEGF的表達(dá)。結(jié)論HSP90抑制劑Ganetespib能抑制PC12細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制HSP90、VEGF蛋白表達(dá)。

關(guān)鍵詞:嗜鉻細(xì)胞瘤；PC12細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子；熱休克蛋白90；Ganetespib

嗜鉻細(xì)胞瘤(pheochromocytomas, PCCs)是一種腎上腺髓質(zhì)和腎上腺外交感神經(jīng)系統(tǒng)起源的腫瘤，年發(fā)病率約為2/100萬～8/100萬[1]。惡性嗜鉻細(xì)胞瘤約占全部PCCs的10%，臨床上對惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的治療手段有限，雖然目前外科手術(shù)仍是治療惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的主要手段，但很難達(dá)到使患者痊愈的目的。分子靶向治療是惡性嗜鉻細(xì)胞瘤治療發(fā)展的必然趨勢，而新生血管的形成對腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移起到極其重要的作用，因此對血管生成進(jìn)行有效抑制可作為干擾腫瘤生長的重要靶點(diǎn)。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前所知的作用最強(qiáng)的促血管形成的因子，在生理及病理情況下均能夠有效誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移，從而介導(dǎo)新生血管形成[2]。

熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)是一種廣泛存在于各類細(xì)胞中的分子伴侶，其能夠參與蛋白質(zhì)的正確折疊，從而維持其結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定。而其部分客戶蛋白與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤性血管形成以及轉(zhuǎn)移等腫瘤相關(guān)事件有關(guān)[3]。目前，流行病學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床等多方面資料證實(shí)，通過抑制HSP90能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4]。HSP90有望成為嗜鉻細(xì)胞瘤潛在的靶向治療位點(diǎn)之一。而Ganetespib是新型HSP90抑制劑，其為三唑酮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，其安全性高且療效好，對腫瘤細(xì)胞的抑制作用要明顯強(qiáng)于其他HSP90抑制劑[5]?；谝陨显颍狙芯繑M分析Ganetespib對PC12細(xì)胞的周期、凋亡及VEGF蛋白表達(dá)的影響，初步探討其可能的機(jī)制，從而探索Ganetespib用于治療惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的可能性。

1材料與方法

1.1主要材料大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞(由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科研究所惠贈(zèng))、抗大鼠VEGF、HSP90抗體購自Santa Cruz公司、Ganetespib購自美國Selleck公司、四甲基偶氮唑鹽(3, -4, 5 dimethyliazol -2, 5 diphenyl tetrazolium bromide, MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自美國sigma公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將PC12細(xì)胞置于含10%馬血清、5%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、1%雙抗(體積分?jǐn)?shù))的DMEM培養(yǎng)基中，在5% CO2(體積分?jǐn)?shù))恒溫孵育箱中培養(yǎng)，常規(guī)傳代。然后將PC12細(xì)胞接種于96孔板(MTT)或6 cm皿(流式細(xì)胞儀或蛋白質(zhì)檢測)，細(xì)胞密度70%～80%用于實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法測定細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為DMSO組(陰性對照組)、未處理組、空白對照組及Ganetespib組(實(shí)驗(yàn)組)。取處于對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞制成5×104/mL細(xì)胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，然后分別加入不同終濃度的Ganetespib的培養(yǎng)液(0.01、0.02、0.1 μmol/L、0.2 μmol/L)?？瞻讓φ湛字患优囵B(yǎng)液不加細(xì)胞，陰性對照每孔加入100 μL細(xì)胞懸液以及DMSO，96孔板四周加入PBS填充，每孔設(shè)5個(gè)復(fù)孔。然后分別于用藥后12、24、36、48、60、72 h加入5% MTT溶液10 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)液體，而后每孔加入200 μL DMSO，搖床上搖勻10 min后用酶標(biāo)儀檢測其在570 nm吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率(%)=1-(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A陰性組-A空白組)×100%。

1.4細(xì)胞周期檢測收集實(shí)驗(yàn)處理過的對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液(每管至少2×105個(gè)細(xì)胞)，1 000 r/min離心5 min，棄去上清后，用PBS溶液清洗一次，在離心管中留約0.5 mLPBS，加入70%冰乙醇5 mL混勻固定，4 ℃放置48 h以上。檢測時(shí)，離心離去乙醇，PBS清洗一次，在離心管中留1 mL PBS，打散細(xì)胞團(tuán)，加入Rnase 5 μL(10 g/L)，37 ℃放置1 h，加入PI(0.1 g/L)染液，室溫避光染色30 min，計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期時(shí)相。

1.5細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，于無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，常規(guī)消化，用無血清DMEM制成單細(xì)胞懸液，以50 000個(gè)/孔濃度加入Transwell小室，上室加入小劑量Ganetespib，作為實(shí)驗(yàn)組。在下室加入500 μL含有10%FBS的完全培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，用10%甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.6Western blot法檢測HSP90、VEGF表達(dá)收集處理后的細(xì)胞，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞2遍，加入RIPA、PMSF、Cocktail(體積比100∶1∶10)，超聲粉碎細(xì)胞，于冰上裂解30 min。4 ℃ 12 000 r/min 30 min，離心收集上清液，定量后4×Loading煮沸，-20 ℃保存。用BSA法測定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白濃度,按30 μg/孔上樣，取蛋白樣品到10% SDS-PAGE中電泳，轉(zhuǎn)膜后在3%BSA中室溫下封閉l h，加一抗HSP90(1∶1 500)，VEGF(1∶500)、β-actin(1∶1 000)。TBST洗滌3次后與3%BSA稀釋的相應(yīng)二抗(1∶10 000)作用1 h，使用Image Lab for Window軟件進(jìn)行顯影。

2結(jié)果

2.1Ganetespib對PC12細(xì)胞增殖的抑制作用實(shí)驗(yàn)組MTT法檢測結(jié)果表明Ganetespib對PC12細(xì)胞具有明顯的抑制增殖作用，在0.01～0.1 μmol/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量-時(shí)間相關(guān)性，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1　Ganetespib不同濃度梯度作用在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率

2.2細(xì)胞周期檢測實(shí)驗(yàn)組檢測：按不同濃度Ganetespib作用于細(xì)胞后，于24 h后流式細(xì)胞儀測定其細(xì)胞周期，結(jié)果顯示：0.2 μmol/L濃度組G0/G1期細(xì)胞明顯增加，與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而0.01、0.02、0.1 μmol/L組與對照組相比，其G0/G1期細(xì)胞并未明顯增加，各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。說明較大劑量的Ganetespib可以使PC12細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯。流式結(jié)果見圖2。

圖2流式細(xì)胞儀測定不同濃度Ganetespib對細(xì)胞周期影響

對照組、0.01 μmol/L組、0.02 μmol/L組、0.1μmol/L組、0.2 μmol/L組G0/G1期細(xì)胞比例分別為為69.74%、71.93%、70.64%、67.29%、87.4%。

2.3細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)使用小劑量的Ganetespib作用于PC12細(xì)胞48 h后，可明顯抑制PC12細(xì)胞的遠(yuǎn)處遷移能力，與對照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

圖3　細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(結(jié)晶紫染色,×40)

2.4Western blot檢測VEGF、HSP90蛋白的水平使用小劑量的Ganetespib作用于細(xì)胞后24 h，可使HSP90、VEGF蛋白表達(dá)明顯減少，各組與未處理組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

圖4　Western blot檢測Ganetespib對PC12細(xì)胞VEGF、HSP90蛋白表達(dá)影響

3討論

近年來，隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人群中腎上腺腫瘤的檢出率明顯升高，腫瘤種類呈現(xiàn)多樣化，因此其預(yù)后各不相同。對于其中良性病變，單純手術(shù)治療就可使患者獲得痊愈。作為一種少見的腎上腺髓質(zhì)來源的神經(jīng)內(nèi)分泌性惡性腫瘤，惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的惡性程度較高，并且只有當(dāng)該腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)灶或非嗜鉻組織出現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶后，才能確診為惡性嗜鉻細(xì)胞瘤。腫瘤的上述性質(zhì)限制了其早期診斷與治療。因此，尋找新型的靶向分子可能有助于惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的早期發(fā)現(xiàn)與治療，從而為解決目前惡性嗜鉻細(xì)胞瘤診療困難這一難題提供線索。

細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。近年來，人們通過對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，發(fā)現(xiàn)多種信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、生長因子及其受體在惡性嗜鉻細(xì)胞瘤中過度表達(dá)，可能與其發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。而HSP90是一種高度保守的分子伴侶，能夠調(diào)控其客戶蛋白的正確折疊與保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。HSP90的靶客戶蛋白種類超過200種，包括多種蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子以及部分類固醇激素受體[6]。在腫瘤細(xì)胞中，HSP90能夠調(diào)節(jié)異常折疊的癌基因相關(guān)蛋白，以維持該類蛋白的功能，從而引起腫瘤的進(jìn)展[7]。HSP90的客戶蛋白，如SRC、AKT、PKC、PDK-1等，均有研究證實(shí)其參與了腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移以及血管形成等過程[8-9]。此外，我們前期研究發(fā)現(xiàn)：HSP90在惡性嗜鉻細(xì)胞瘤組織中表達(dá)異常增高，提示HSP90通路的異常表達(dá)可能與腫瘤新生血管形成及惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]。因此，特異性阻斷HSP90可能影響到腫瘤細(xì)胞中多個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的生長周期、凋亡、遷移、侵襲及血管生成等方面產(chǎn)生抑制作用。

Ganetespib是一種新型的HSP90抑制劑，其能夠有效結(jié)合HSP90蛋白N端的ATP結(jié)構(gòu)域，抑制HSP90與底物蛋白結(jié)合的過程，從而引起底物蛋白降解，進(jìn)而阻斷多種與腫瘤細(xì)胞功能相關(guān)的蛋白信號通路。JHAVERI 等[11]將Ganetespib應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，他們發(fā)現(xiàn)與17-AAG相比，患者對Ganetespib的耐受性更高，化療相關(guān)副反應(yīng)更少；并且，Ganetespib對過表達(dá)HSP90的乳腺癌患者療效更佳。因此，為了更深入地探討Ganetespib對惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的抗腫瘤作用，本研究采用Ganetespib對PC12細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理，以特異性抑制HSP90蛋白，從而影響到多種相關(guān)客戶蛋白及其信號通路，進(jìn)而討論其對PC12生長、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移等生物學(xué)行為的抑制作用，旨在發(fā)現(xiàn)HSP90在惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的發(fā)展、增殖方面的作用，從而為探尋對其治療方法提供新的途徑。

腫瘤性血管形成在惡性腫瘤生長、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為方面起著重要的作用，與惡性腫瘤的治療及預(yù)后息息相關(guān)，而惡性腫瘤血管形成直接受到促血管生成因子所誘導(dǎo)[12]。作為最重要的促血管生成因子之一，VEGF可特異性與其受體VEGFR2結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并提高其遷移能力，協(xié)助腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而增加惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的幾率[13]。VEGF誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的上述行為可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)，包括PI3K/Akt、FAK、ERKs及MAPK等信號通路[14]。另外，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，直徑大于5 cm的腎上腺皮質(zhì)腫瘤的VEGF陽性表達(dá)率高于直徑小于5 cm的腫瘤，提示VEGF的高表達(dá)可能與腎上腺腫瘤生長相關(guān)[15]。

為進(jìn)一步明確Ganetespib對PC12細(xì)胞的生長抑制及對細(xì)胞周期的影響是否與VEGF有關(guān)，本研究采用Ganetespib對PC12細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)采用Western blot印跡法檢測VEGF表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，小劑量Ganetespib處理PC12細(xì)胞24 h后，就可明顯抑制VEGF表達(dá)，表明Ganetespib能夠明顯抑制VEGF表達(dá)。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示小劑量的Ganetespib處理PC12細(xì)胞即可明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長及遷移能力，并且0.2 μmol/L濃度的Ganetespib就可使PC12細(xì)胞明顯阻滯于G0/G1期。鑒于Ganetespib對PC12細(xì)胞的增殖抑制、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞遷移抑制及抑制VEGF表達(dá)，HSP90途徑有望成為治療惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的新靶點(diǎn)。

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(編輯王瑋)

收稿日期：2015-04-07修回日期：2015-05-10

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(No.81272936)；上海市科委醫(yī)學(xué)引導(dǎo)項(xiàng)目(No.134119a2700)

通訊作者:祝宇，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師.E-mail：zyyyhyq@126.com

作者簡介:廉建坡(1990-),男(漢族)，學(xué)士學(xué)位,在讀碩士研究生，研究方向：泌尿系腫瘤.E-mail：showljp@sina.com

中圖分類號:R736.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.01.014

The inhibitory effect of Ganetespib on the apoptosis and VEGF expression of PC12 cells

LIAN Jian-po, CHEN Dong-ning, ZHU Yu, XU Lie-yu, ZHANG Chong-yu, RUI wen-bing, WU Yu-xuan, SHEN Zhou-jun, NING Guang

(Department of Urology, Ruijin Hospital, Medical School of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo evaluate the effect of heat shock protein 90 (HSP90) inhibitor, Ganetespib, on the proliferation and expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in PC12 cells in vitro. MethodsThe inhibition effect during the proliferation of PC12 cells treated with Ganetespib was evaluated with MTT assay. The cell cycle of PC12 cells was determined with flow cytometry. The expressions of HSP90 and VEGF were detected with Western blot. ResultsGanetespib significantly inhibited the proliferation of PC12 cells in vitro in a dose-dependent manner with an IC50 value of 200nM. Ganetespib inhibited the expression of HSP90 and VEGF.ConclusionGanetespib inhibited PC12 cell proliferation, cell cycle and the expression of HSP90 and VEGF.

KEY WORDS:pheochromocytoma; PC12 cells; vascular endothelial growth factor; heat shock protein 90; Ganetespib