馮泮飛　劉軍花　葉慧敏　朱偉云　毛勝勇

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京210095)

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寡果糖誘導(dǎo)瘤胃急性酸中毒對山羊瘤胃發(fā)酵、蹄組織結(jié)構(gòu)及炎癥因子、金屬蛋白酶表達(dá)的影響

馮泮飛劉軍花葉慧敏朱偉云毛勝勇*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京210095)

摘要：本試驗旨在研究寡果糖誘導(dǎo)瘤胃酸中毒對山羊瘤胃發(fā)酵、蹄組織結(jié)構(gòu)、蹄部炎癥因子及金屬蛋白酶表達(dá)的影響。采用隨機區(qū)組設(shè)計，將8頭健康裝有永久性瘤胃瘺管的波雜山羊(波爾山羊×長江三角洲白山羊)隨機分為對照組和誘導(dǎo)酸中毒的試驗組，每組4頭。其中試驗組山羊瘤胃寡果糖灌注量為21 g/kg BW。分別于灌注前(0 h)和灌注后4、8、12、24和48 h采集瘤胃液，同時分別在0、4、8、24和48 h通過頸靜脈采集血液，灌注后48 h屠宰2組山羊，采集蹄組織。結(jié)果表明：與對照組相比，試驗組山羊瘤胃液pH、揮發(fā)性脂肪酸濃度平均值顯著降低(P<0.05)，血液和瘤胃液中乳酸和脂多糖濃度平均值顯著提高(P<0.05)；組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，與對照組相比，試驗組山羊蹄組織中次級表皮蹄小葉和次級真皮蹄小葉的長度變短，蹄小葉形狀不規(guī)則；實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，較對照組比較，試驗組山羊蹄組織中基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1的mRNA的相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，白細(xì)胞介素-6、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2的mRNA的相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。結(jié)果提示，寡果糖誘導(dǎo)山羊急性瘤胃酸中毒可導(dǎo)致山羊瘤胃發(fā)酵紊亂，提高瘤胃液和血液中脂多糖與乳酸濃度，導(dǎo)致山羊蹄組織相關(guān)炎癥因子與金屬蛋白酶表達(dá)改變，最終引發(fā)山羊急性蹄葉炎。

關(guān)鍵詞：山羊；寡果糖；炎癥因子；基質(zhì)金屬蛋白酶；蹄葉炎

蹄是牛、羊等反芻動物重要的支持和運動器官，蹄的健康直接關(guān)系到這些動物的生產(chǎn)性能。蹄葉炎是動物蹄小葉(包括真皮小葉與角小葉)的一種彌散型的、非感染性的真皮損傷[1-2]。調(diào)查顯示，蹄葉炎是當(dāng)前集約化養(yǎng)殖下奶牛、綿羊及山羊常見疾病之一[3]，盡管報道認(rèn)為引發(fā)動物蹄葉炎的因素很多，但眾多學(xué)者認(rèn)為，飼喂高精料飼糧可能是誘發(fā)草食動物蹄葉炎的最主要原因之一。

目前有關(guān)高精料飼糧引發(fā)蹄葉炎的最主要證據(jù)來自于對馬蹄葉炎的研究。研究表明，灌注寡果糖可導(dǎo)致馬后腸發(fā)酵紊亂，腸道黏膜屏障受損，消化道內(nèi)一些異常代謝產(chǎn)物如脂多糖(lpopolysaccharides,LPS)等可移位進入體內(nèi)，使蹄組織中一類基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)含量升高，由于MMP主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)和基膜[4-8]，MMP活性升高可促進細(xì)胞外基質(zhì)與基膜的降解，使表皮與真皮相連的蹄小葉組織被破壞，最終使蹄與真皮直接接觸，導(dǎo)致蹄葉炎。由于這些結(jié)果均來自于馬蹄葉炎的研究，其在牛、羊等反芻動物上是否有類似現(xiàn)象，并不清楚。

基于以上情況，本試驗假設(shè)對山羊瘤胃灌注寡果糖能夠引發(fā)急性酸中毒，繼而誘發(fā)蹄葉炎。為此，本研究以寡果糖灌注山羊瘤胃，研究了其對山羊瘤胃發(fā)酵及蹄組織結(jié)構(gòu)、炎癥因子及金屬蛋白酶表達(dá)的影響，旨在進一步了解反芻動物蹄葉炎的發(fā)病機制，并為建立一種低成本的蹄葉炎研究模型提供理論依據(jù)。

1材料方法

1.1試驗動物及飼糧

選用8頭健康、體重相近、無蹄葉炎病史的2

歲的安裝有永久性瘤胃瘺管未閹割的波雜公山羊(波爾山羊×長江三角洲白山羊，體重約為26 kg，裝有瘤胃瘺管)，統(tǒng)一驅(qū)蟲、單欄飼養(yǎng)。基礎(chǔ)飼糧配制參照我國《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》NY/T 816—2004[9],基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，每頭每天飼喂飼糧450 g。日喂2次(08：00和17：00)，等量飼喂，自由飲水。

1.2試驗設(shè)計

試驗于2015年9月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物房進行。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1　Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)　%

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of the diet：MnSO4153 mg，ZnSO4186 mg，F(xiàn)eSO4125 mg，CoCl28.25 mg，KIO325 mg，CuSO433 mg，NaSeO34 mg，VA 15.28 mg，VE 0.47 mg。

2)營養(yǎng)水平參考文獻(xiàn)[10]的方法計算。Nutrient levels were calculated according to the method in reference [10].

試驗開始后，將上述8頭山羊隨機分為對照組與試驗組，每組4頭。將寡果糖用去離子水溶解，按21 g/kg BW的劑量對試驗組山羊通過瘤胃瘺管灌注，對照組則灌注等體積去離子水。為了讓瘤胃微生物適應(yīng)寡果糖，正試期開始前3 d，試驗組山羊每天灌注正式劑量的5%作為過渡，每天灌注2次。正試期分別于灌注前0 h和灌注后4、8、12、24和48 h采集瘤胃液，同時于灌注前0 h和灌注后4、8、12、24和48 h通過頸靜脈采集血液，灌注后48 h后立即屠宰。

1.3樣品采集

在上述各取樣時間點，利用自制負(fù)壓裝置，分別通過8頭山羊瘤胃瘺管各采集20 mL瘤胃液，所采瘤胃液經(jīng)4層紗布過濾后，將濾液置于潔凈的燒杯中，混合均勻后，立即測定瘤胃液pH，而后將瘤胃液轉(zhuǎn)入離心管中，-20 ℃凍存，備測揮發(fā)性脂肪酸、乳酸和LPS濃度。在上述時間點，利用負(fù)壓采血管從山羊頸靜脈采集血液，室溫靜置30 min后，將血液轉(zhuǎn)入離心管中，3 500×g離心10 min，取上清，-20 ℃凍存，備測乳酸和LPS濃度。48 h后全部屠宰，屠宰后使用電鋸鋸下山羊蹄部[11]，采集蹄部組織[6,12]，一部分蹄組織立即置于液氮罐中保存；另一部分立刻放入4%的福爾馬林溶液中，備用于蹄小葉形態(tài)結(jié)構(gòu)觀測。

1.4測定方法

1.4.1瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定

使用pH計(HI-9125，意大利HANNA公司)測定瘤胃液pH，采用氣相色譜法(GC-14B 氣相色譜儀，日本島津公司，柱溫130 ℃，氣化室溫度180 ℃，檢測器溫度180 ℃)測定揮發(fā)性脂肪酸濃度[13]，采用比色法測定瘤胃液和血液中乳酸的濃度[14]，使用顯色基質(zhì)鱟試劑盒(廈門鱟試劑實驗廠有限公司)測定瘤胃液和血液中的LPS濃度[15]。

1.4.2組織切片的處理

蹄組織用4%的多聚甲醛固定，而后經(jīng)洗滌、酒精梯度脫水、浸蠟、包埋、切片、帖片、脫蠟復(fù)水、蘇木精-伊紅(HE)染色和封固后，切片在光鏡下觀察蹄小葉形態(tài)的變化。

1.4.3總RNA的提取和cDNA的合成

1.4.4實時定量PCR

炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)的引物序列參照Liu等[17]，MMP-2、MMP-9、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(membrane type-1 matrix metalloproteinases，MT1-MMP)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1(tissue inhibitors of metalloproteinases-1，TIMP-1)則根據(jù)GenBank上牛和羊的保守核酸序列，應(yīng)用Primer 3.0 軟件進行引物設(shè)計。所有引物序列如表2所示。所有引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。采用實時定量PCR法(StepOnePlusTM Real-Time PCR System，美國Applied Biosystems公司)對目的基因及內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)進行定量。目的基因的相對表達(dá)量以GAPDH作為內(nèi)參進行校正，基因表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進行處理。

表2　引物序列Table 2　The primer sequences

1.5數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步整理后，瘤胃液pH、揮發(fā)性脂肪酸濃度、瘤胃液與血液中乳酸及LPS濃度采用SPSS 20.0的一般線性模型里的重復(fù)度量進行分析，而炎癥因子及金屬蛋白酶mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異顯著,基因相對表達(dá)量采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，其他數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。

2結(jié)果與分析

2.1瘤胃液pH

由圖1可見，試驗組山羊的瘤胃液pH在灌胃后立即下降，在24 h達(dá)到最低點，24～48 h開始緩慢上升。與對照組相比，試驗組瘤胃液pH平均值顯著降低(P<0.05)。瘤胃液pH<5.6通常認(rèn)為是酸中毒；pH在5.0～5.6之間為亞急性瘤胃酸中毒或慢性瘤胃酸中毒；而pH<5.0接近4.5或是更低稱為急性酸中毒，本試驗中試驗組瘤胃液pH在8 h后低于5，且持續(xù)至試驗結(jié)束，顯示試驗組山羊發(fā)生了急性瘤胃酸中毒。

圖1　灌胃寡果糖對山羊瘤胃液pH的影響Fig.1　Effects of intragastric administration of fructan on ruminal liquid pH of goats (n=4)

2.2瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸濃度

由圖2可見，試驗組的乙酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度自灌注后4 h開始下降，乙酸濃度在12 h達(dá)到最低點，之后開始緩慢上升，丙酸、丁酸和戊酸濃度在灌注后24 h達(dá)最低點，之后保持不變；而異丁酸和異戊酸濃度從灌胃之后立即下降，在24 h達(dá)到最低點，之后濃度保持不變。較對照組比較，試驗組山羊瘤胃內(nèi)乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸濃度平均值均顯著降低(P<0.05)。

2.3瘤胃液和血液中乳酸和LPS濃度

由圖3可見，在0～24 h內(nèi)，試驗組的山羊瘤胃液中乳酸濃度持續(xù)上升，24 h乳酸濃度均值達(dá)12 mmol/L，同時血液中乳酸濃度也持續(xù)上升，48 h達(dá)峰值；試驗組山羊瘤胃液及血液LPS濃度在灌注后0～12 h內(nèi)持續(xù)上升，12 h達(dá)峰值，而后逐漸下降。較對照組比較，試驗組血液與瘤胃液中乳酸和LPS濃度平均值均顯著升高(P<0.05)。

2.4急性酸中毒對山羊蹄部組織形態(tài)學(xué)的影響

由圖4可見，對照組可以明顯地看出蹄小葉的組織結(jié)構(gòu)分為初級表皮蹄小葉(primary epidermal lamellae,PEL)、次級表皮蹄小葉(secondary epidermal lamellae,SEL)、次級真皮蹄小葉(secondary dermal lamellae,SDL)和初級真皮蹄小葉(primary dermal lamellae,PDL)。與對照組相比，試驗組山羊次級表皮蹄小葉和次級真皮蹄小葉的長度變短，并且形狀變得不規(guī)則、不對稱。

2.5蹄小葉炎癥因子mRNA相對表達(dá)量

由表3可見，與對照組比較，試驗組的山羊蹄炎癥因子IL-6的mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，但I(xiàn)L-1β和TNF-α的mRNA相對表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)。

2.6蹄小葉MMP mRNA相對表達(dá)量

由表4可見，與對照組比較，試驗組山羊蹄小葉中的MMP-2、MT1-MMP的mRNA相對表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，TIMP-1 mRNA相對表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，而2組間MMP-9的mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

3討論

本研究通過行為學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在灌注寡果糖后24 h，試驗組山羊表現(xiàn)明顯跛行行為，結(jié)合后序的HE染色觀察蹄組織的形態(tài)學(xué)結(jié)果，試驗結(jié)果顯示本試驗成功誘發(fā)山羊急性蹄葉炎。該結(jié)果也為未來深入研究反芻動物蹄葉炎提供了一種低成本的研究方法。

瘤胃酸中毒是反芻動物長期過多飼喂谷類或多糖類詞料，導(dǎo)致瘤胃發(fā)酵異常產(chǎn)生大量乳酸和有機酸,臨床上是以酸中毒和瘤胃內(nèi)某些微生物群活性降低為特征的瘤胃消化機能紊亂性疾病。根據(jù)瘤胃液pH變化范圍,瘤胃酸中毒又分為急性酸中毒(長期瘤胃液pH<5.0)和亞急性酸中毒(pH長期在5.0～5.6范圍內(nèi))[18-19]。本研究中，灌注寡果糖組山羊瘤胃液pH快速下降至5.0以下，并持續(xù)約40 h，表明試驗組動物發(fā)生了急性瘤胃酸中毒。研究顯示，急性酸中毒條件下瘤胃牛鏈球菌生長速度加快，產(chǎn)生大量乳酸，乳酸積累導(dǎo)致瘤胃液pH持續(xù)下降[20]。本研究中，試驗組灌注寡果糖后瘤胃乳酸濃度持續(xù)上升，結(jié)果達(dá)到預(yù)期試驗?zāi)康模才c上述報道一致。但到24 h后乳酸濃度開始下降，原因可能是碳水化合物被消耗完畢，抑或乳酸利用菌數(shù)量逐漸恢復(fù)，使乳酸被利用。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的主要成份，我們以前的研究顯示，飼喂高谷物飼糧導(dǎo)致瘤胃內(nèi)LPS濃度增加，瘤胃上皮屏障功能受損[21]。本研究顯示，試驗組山羊瘤胃液與外周血液中LPS濃度顯著升高，說明急性酸中毒導(dǎo)致瘤胃菌群紊亂，LPS濃度升高，同時消化道上皮屏障受損，引發(fā)LPS移位，最終致外周血液中LPS濃度顯著升高。

圖2　急性酸中毒對山羊瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響Fig.2　Effects of acute acidosis on concentrations of volatile fatty acids in ruminal liquid of goats

對馬蹄葉炎的研究結(jié)果表明，蹄葉炎條件下馬蹄組織中金屬蛋白酶活性顯著升高。研究顯示，金屬蛋白酶的酶活性受基因水平的轉(zhuǎn)錄、酶原活化和酶活性抑制調(diào)節(jié)[22]。在轉(zhuǎn)錄水平上，前炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6、TNF-α等能誘導(dǎo)和/或刺激金屬蛋白酶活性在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)[23-24]。在酶原活化上，金屬蛋白酶活性以酶原形式在細(xì)胞內(nèi)合成，并最終被分泌到細(xì)胞外，其必須依靠其他酶的激活，其中無活性的MMP-2酶原(ProMMP-2)必須通過游離的MT1-MMP作用，方能形成有活性的MMP-2；MMP-9活化過程為：首先由MT1-MMP激活ProMMP-13成為有活性的MMP-13，MMP-13進而活化ProMMP-9，形成有活性的MMP-9[25]。在酶活抑制上，MMP活性受基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)的抑制，其基本原理是TIMP通過其氨基酸功能區(qū)的半胱氨酸殘基與活化MMP的鋅離子活性中心相結(jié)合以1∶1的比例形成復(fù)合體，從而阻斷MMP與底物的結(jié)合，進而抑制MMP的酶活性。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，試驗組山羊蹄組織中IL-6的mRNA相對表達(dá)量顯著升高；MMP-2和MT1-MMP的mRNA相對表達(dá)量也顯著升高，而TIMP-1的mRNA相對表達(dá)量顯著下降。結(jié)合LPS及乳酸的測定結(jié)果，本試驗結(jié)果說明，瘤胃酸中毒下，外周循環(huán)中的致炎因子如LPS與乳酸等可能通過炎性因子如IL-6在轉(zhuǎn)錄水平上激活金屬蛋白酶的表達(dá)，同時也可能通過調(diào)節(jié)MT1-MMP和TIMP-1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進而提高MMP的活性，最終導(dǎo)致蹄小葉被降解，蹄組織被破壞，引發(fā)蹄葉炎。

圖3　急性酸中毒對山羊瘤胃液和血液中乳酸和LPS濃度的影響Fig.3　Effects of acute acidosis on concentrations of lactic acid and LPS in ruminal liquid and blood of goats

PEL：初級表皮蹄小葉 primary epidermal lamellae；SEL：次級表皮蹄小葉 secondary epidermal lamellae；PDL：初級真皮蹄小葉 primary dermal lamellae；SDL：次級真皮蹄小葉 secondary dermal lamellae。

A(10×)、B(40×)：對照組 Control group；C(10×)、D(40×)：試驗組Test group。

圖4　急性酸中毒對山羊表皮蹄小葉和真皮蹄小葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig.4　Effects of acute acidosis on histologic appearance of dermal and epidermal lamellae in hooves of goats 表3　急性酸中毒對山羊蹄小葉炎癥因子mRNA相對表達(dá)量的影響Table 3　Effects of acute acidosis on mRNA relative expression levels of inflammatory cytokines in lamellae of hooves of goats

表4　急性酸中毒對山羊蹄小葉基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA相對表達(dá)量的影響Table 4　Effects of acute acidosis on mRNA relative expression levels of matrix metalloproteinases in lamellae of hooves of goats

4結(jié)論

瘤胃灌注寡果糖可以引起山羊急性瘤胃酸中毒，進而導(dǎo)致瘤胃與外周循環(huán)中LPS與乳酸濃度增加，這些致炎因子可能通過提高炎癥因子的表達(dá)，進而影響蹄組織中金屬蛋白酶的相對表達(dá)，最終破壞蹄小葉的正常結(jié)構(gòu)，誘發(fā)急性蹄葉炎。

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(責(zé)任編輯王智航)

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.07.033

收稿日期：2016-01-11

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31372339)

作者簡介：馮泮飛(1990—)，男，山東威海人，碩士研究生，從事反芻動物營養(yǎng)研究。E-mail： 2013105037@njau.edu.cn *通信作者：毛勝勇，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： maoshengyong@163.com

中圖分類號：S826;S816.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)07-2260-09

*Corresponding author, professor, E-mail： maoshengyong@163.com

Effects of Ruminal Acute Acidosis Induced by Fructo-Oligosaccharide on Ruminal Fermentation, Hooves Structure and Expressions of Inflammatory Cytokines and Matrix Metalloproteinase of Goats

FENG PanfeiLIU JunhuaYE HuiminZHU WeiyunMAO Shengyong*

(College of Animal Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract:The present study aimed to investigate the effects of ruminal acute acidosis induced by fructo-oligosaccharide on ruminal fermentation, hooves structure and expressions of inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase of goats. Eight healthy crossbred goats (Boer goat×Yangtze River delta white goats) with permanent ruminal fistulas were randomly divided into two groups, including control and test groups which was treated with fructo-oligosaccharide infusion (21 g/kg BW), and each group had 4 goats. Ruminal liquid and blood were collected respectively at 0 (before infusion), 4, 8, 12, 24 and 48 h, as well as 0, 4, 8, 24 and 48 h after infusion. The goats were slaughtered to collect for hooves tissue after 48 h of infusion. The results showed as follows, compared with control group, the average values of ruminal liquid pH, volatile fatty acids was significantly decreased in test group (P<0.05), while the average values of the concentrations of lactic acid and lipopolysaccharide (LPS) in ruminal liquid and blood were significantly increased (P<0.05); the results of histology suggested that compared with control group, secondary epidermal lamellae and secondary dermal lamellae were shortened in test group; the real-time PCR results revealed that compared with control group, the mRNA expression of tissue inhibitors of metalloproteinases-1 (TIMP-1) was significantly decreased in test group (P<0.05), while those of interleukin-6 (IL-6), matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) and membrane type-1 matrix metalloproteinases (MT1-MMP) in goat hooves were significantly increased (P<0.05). In conclusion, ruminal acute acidosis induced by fructo-oligosaccharide causes the disorder of ruminal fermentation and increases concentrations of LPS and lactic acid in ruminal liquid and blood, which further changes of mRNA expressions of pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase genes related to laminitis, and finally induces the laminitis in goats.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(7)：2260-2268]

Key words:goat; fructo-oligosaccharide; inflammatory cytokines; matrix metalloproteinase; laminitis