陳明明，潘小霞，鄭法文，陳麗容，李燕婧，范建華，韋立富（.南寧市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南寧 500；.南寧市第一人民醫(yī)院，南寧 500；.廣西中醫(yī)藥研究院，南寧500）

?

·動物實驗·

朱璉針刺興奮法對缺血缺氧性腦損傷幼鼠神經(jīng)細胞凋亡和PI3K、AKt、Caspase-3蛋白表達的影響

陳明明1，潘小霞1，鄭法文2，陳麗容1，李燕婧3，范建華3，韋立富1
（1.南寧市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南寧 530012；2.南寧市第一人民醫(yī)院，南寧 530021；3.廣西中醫(yī)藥研究院，南寧530022）

【摘要】目的觀察朱璉針刺興奮法不同時機介入對缺血缺氧性腦損傷幼鼠神經(jīng)細胞凋亡和組織PI3K（phosphatedylinositol 3-kinase）、AKt（Serine/threonine kinase）、Caspase-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3）蛋白表達的影響。方法將50只7日齡大鼠隨機分為A組（興奮法針刺Ⅰ組）、B組（興奮法針刺Ⅱ組）、C組（模型組）、D組（假手術(shù)組）和E組（正常對照組），每組10只。A組和E組從造模24 h內(nèi)開始針刺；B組從造模第8天開始針刺；C組和D組不做針刺處理。各組動物于造模后的第21天處死，采用原位末端標記（TUNEL）技術(shù)檢測腦神經(jīng)細胞凋亡，采用免疫組化法測定腦組織PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表達。結(jié)果A組和B組凋亡細胞數(shù)明顯少于C組（P＜0.01，P＜0.05）；與B組比較，A組凋亡細胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。與C組比較，A組和B組PI3K、Akt蛋白表達明顯增高，Caspase-3蛋白表達明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。與B組比較，A組PI3K表達明顯增高，Caspase-3蛋白表達明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論朱璉針刺興奮法具有抑制缺血缺氧性腦損傷幼鼠神經(jīng)細胞凋亡，能刺激PI3K/Akt信號通路的表達，增強PI3K、AKt活性，降低Caspase-3蛋白表達的作用。且早期介入朱璉針刺興奮法，對缺血缺氧性腦損傷幼鼠的腦神經(jīng)保護作用意義重大。

【關(guān)鍵詞】針刺療法；朱璉針刺興奮法；腦損傷；幼鼠；細胞凋亡；PI3K；AKt；Caspase-3

小兒腦性癱瘓（cerebral palsy，CP）又稱腦癱，是小兒出生前到出生后1個月內(nèi)因各種原因所引起的腦損傷或發(fā)育缺陷所致的運動障礙及姿勢異常，常伴有智力低下、癲癇、語言障礙等［1］，臨床上缺血缺氧性腦損傷（hypoxia-ischemia brain damage，HIBD）是引起新生兒CP的主要原因。凋亡是腦缺血的神經(jīng)細胞損傷的重要機制之一。近年來研究［2］表明，PI3K/Akt信號通路是缺血再灌注后引起細胞凋亡、氧化應(yīng)激等過程的重要信號通路。而Caspase-3蛋白在各種因素啟動的凋亡程序中起重要的樞紐作用。本實驗研究采用原位末端標記（TUNEL）技術(shù)和免疫組化法，觀察朱璉針刺興奮法在不同時機介入對缺血缺氧性腦損傷幼鼠神經(jīng)細胞凋亡數(shù)及PI3K、AKt、Caspase-3蛋白表達的影響，探討朱璉針刺興奮法治療CP的可能作用機制，為有效治療CP提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組

選用7日齡新生SD大鼠50只，雌雄各半，體重為12～14 g，SPF級，動物由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（許可證號SCXK桂2009-0002）。根據(jù)幼鼠體重隨機分為A組（興奮法針刺Ⅰ組）、B組（興奮法針刺Ⅱ組）、C組（模型組）、D組（假手術(shù)組）和E組（正常對照組），每組10只。A組、B組和E組進行朱璉針刺興奮法一型處理，C組和D組不作針刺處理。5組喂養(yǎng)方式、生活環(huán)境相同。

1.2主要儀器及試劑

Image master圖像分析儀（美國 Pharmacia Bioten公司）；LeicaCM1950冷凍切片機（德國萊卡公司）；雙目光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；華佗牌0.25 mm×25 mm一次性無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。TUNEL細胞凋亡，PI3K、Akt、Caspase-3兔抗大鼠多克隆試劑盒（Santa Cruz公司）；DAB染液（武漢博士德生物公司）。

1.3動物模型制備及干預(yù)措施

1.3.1動物模型制備［3］

幼鼠在乙醚吸入淺麻醉狀態(tài)下，切開頸部皮膚，分離左頸總動脈并結(jié)扎，縫合切口，術(shù)后返回母鼠籠中，恢復(fù)2 h后，置于37℃恒溫水浴的密閉容器中，以1 L/min的速度通入低氧氣體（體積濃度為8%的氧氣和92%的氮氣），2.5 h后將動物取出，繼續(xù)保溫1 h后作行為測定，翻身不能、平衡異常和左旋者視為成功的模型，并返回母鼠籠中飼養(yǎng)。D組麻醉后切開頸部皮膚，分離左頸總動脈后不結(jié)扎，縫合切口后亦不作低氧處理，行為測定均無異常。E組不做任何處理。

1.3.2取穴定位

根據(jù)《實驗針灸學(xué)》［4］，大鼠穴位圖譜定位，選取水溝（唇裂鼻尖下1 mm正中處）、百會（頂骨正中）、大椎（第7頸椎與第1胸椎間，背部正中）、曲池（橈骨近端的關(guān)節(jié)外側(cè)前方的凹陷中取）、合谷（前肢第1、第2掌骨之間）、內(nèi)關(guān)（前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約3 mm的尺橈骨縫間）、足三里（即后三里，在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處）、昆侖（即跟端，后肢外踝與跟腱之間的凹陷中）、太沖（后肢外踝正下方凹陷中）、涌泉（后肢掌心前正中?。?。

1.3.3針刺方法

穴位處皮膚常規(guī)消毒后，行朱璉針刺興奮法一型手法［5］，即采用快速刺入法進針，然后迅速短暫地提插淺刺3次，不留針，迅速抖出法起針。按照水溝、百會、大椎、曲池、合谷、內(nèi)關(guān)、足三里、昆侖、太沖、涌泉的順序針刺。A組和E組從造模24 h內(nèi)開始針刺，自上而下，從左到右。每日1次，間隔24 h后重復(fù)進行，連續(xù)5 d為1個療程，共治療3個療程，療程間休息2 d。B組從造模后第8天開始針刺，取穴和針刺方法同A組，共治療2個療程。C組和E組只予固定，不予針刺。所有實驗幼鼠于造模第21天處死、取腦。針刺操作者需經(jīng)朱璉針灸手法師承培訓(xùn)并臨床實際操作1年以上，并取得中級以上職稱。

1.4標本處理與觀察指標

1.4.1腦組織采集和固定

采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，打開胸腔，暴露心臟，從左心部插入導(dǎo)管至主動脈，松開雙側(cè)止血夾，立即用0.01 mol/L PBS液及4%多聚甲醛對大鼠進行在體灌注，直至大鼠心、肝肺顏色變淺變白，四肢僵硬，然后迅速斷頭，取腦，除去小腦、腦干及嗅球，取左側(cè)半球，冠狀面切開，然后用4%甲醛溶液（PFA）中固定24 h。

1.4.2神經(jīng)細胞凋亡的測定

取4%PFA固定的腦組織，冰凍切片厚度為5 mm，常規(guī)脫水，石蠟包埋。切片，厚度為2m，采用原位末端標記（TUNEL）技術(shù)，用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒進行操作，在熒光顯微鏡下用藍色激發(fā)光照射，在高倍鏡下在皮質(zhì)、紋狀體、海馬區(qū)隨機各取5個視野計數(shù)發(fā)出黃綠色熒光的陽性細胞。

1.4.3PI3K、Akt、Caspse-3表達的測定

取4%PFA固定的腦組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋并切片備用，切片厚4m，然后行常規(guī)脫蠟水化，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、枸櫞鹽酸緩沖液微波法抗原修復(fù)。水洗后，分別加入兔抗大鼠PI3-K、AKt、Caspase-3一抗，漂洗，加二抗，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，用Image master圖像分析儀測量各組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)PI3K、AKt、Caspase-3蛋白表達的陽性細胞吸光度。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSSl3.0軟件進行分析處理。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組幼鼠腦凋亡陽性細胞數(shù)比較

E組腦組織切片僅觀察到散在分布的少量凋亡細胞，C組凋亡細胞數(shù)較E組顯著增多（P＜0.05）。與E組比較，A組和B組凋亡細胞數(shù)均顯著增多（P＜0.05），提示針刺后腦細胞凋亡情況仍然存在，未能達到正常水平；但與C組比較，A組和B組凋亡細胞數(shù)均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），提示朱璉針刺興奮法能抑制缺血缺氧性腦損傷幼鼠腦神經(jīng)細胞凋亡。A組凋亡細胞數(shù)較B組顯著降低（P＜0.05），提示朱璉針刺興奮法早期介入能較明顯地抑制缺血缺氧性腦損傷幼鼠腦神經(jīng)細胞凋亡。詳見表1、圖1。

表1　各組幼鼠腦凋亡陽性細胞數(shù)比較?。ā纒）

表1　各組幼鼠腦凋亡陽性細胞數(shù)比較?。ā纒）

注：與E組比較1）P＜0.01；與C組比較2）P＜0.01，3）P＜0.05；與A組比較4）P＜0.05

組別　例數(shù)　皮質(zhì)區(qū)　紋狀體區(qū)　海馬區(qū)A組　10　3.50±1.43　4.70±2.71　3.20±2.04 B組　10　4.10±2.02　5.40±2.22　3.50±1.58 C組　10　16.80±4.391）　14.50±2.881）　12.30±2.631）D組　10　10.10±1.791）3）　9.50±2.171）3）　9.50±1.721）2）E組　10　13.00±3.531）2）4）　11.8±1.931）2）4）　10.80±1.811）

2.2各組幼鼠腦組織PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表達比較

與E組比較，C組PI3K、Akt蛋白表達明顯減少，Caspase-3蛋白表達明顯增加，兩組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與E組比較，A組和B組PI3K、Akt蛋白表達明顯減少，Caspase-3蛋白表達明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。但與C組比較，A組和 B組 PI3K、Akt蛋白表達明顯增高，Caspase-3蛋白表達明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），提示朱璉針刺興奮法能上調(diào)缺血缺氧性腦損傷幼鼠PI3K、Akt，下調(diào)Caspse-3蛋白的表達。A組PI3K蛋白表達較B組明顯增高，Caspase-3蛋白表達明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示朱璉針刺興奮法早期介入能明顯上調(diào)缺血缺氧性腦損傷幼鼠PI3K，下調(diào)Caspase-3蛋白的表達。詳見表2、圖2。

表2　各組幼鼠腦組織PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表達的比較　（±s,ug/L）

表2　各組幼鼠腦組織PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表達的比較?。ā纒,ug/L）

注：與E組比較1）P＜0.01，2）P＜0.05；與C組比較3）P＜0.01，4）P＜0.05；與A組比較5）P＜0.05

組別　例數(shù)　PI3K　Akt　Casapase-3 A組　10　11.88±2.16　9.52±1.35　0.18±0.54 B組　10　10.77±2.71　9.37±1.49　0.23±0.06 C組　10　6.76±1.651）　6.21±1.191）　0.61±0.131）D組　10　9.37±1.261）4）　7.89±1.372）3）　0.39±0.101）4）E組　10　8.16±1.271）3）5）　8.21±1.744）　0.51±0.101）5）

圖2　各組幼鼠PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表達（免疫組化）

3　討論

朱璉是現(xiàn)當代著名針灸學(xué)家［6］，其在學(xué)術(shù)上建立了一套基于現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)的“新針灸學(xué)”理論體系，提出針灸治病的3個關(guān)鍵因素，即刺激的手法（興奮法和抑制法）、刺激的部位（穴位）和刺激的時機（擇時、療程）。其中，針刺興奮法是針對身體機能處于過度抑制或衰退狀態(tài)者，如休克、癱瘓、麻痹、感覺減退或喪失、精神運動過度抑制等病癥，可起到促進生理機能，解除過度抑制，喚起正常興奮的作用。手法要求取穴較多、刺激量不大、時間短暫（不留針）及患者感覺較輕。本法能使機體產(chǎn)生多個興奮點傳導(dǎo)，沖擊大腦皮層，從而打破大腦皮層的超限制抑制，喚起正常的興奮功能，達到治療疾病目的［7］。但其作用機制并不十分明確。

PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，以磷酸化肌醇環(huán)第三位羥為其功能特點。PI3K激活后可磷酸化細胞膜上的肌醇，產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3通過與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，引發(fā)Akt從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞膜并促使其構(gòu)象發(fā)生改變，進而磷酸化Akt的Thr308和Ser473位點使Akt被活化。Akt又名蛋白激B（PKB），是分子量約為60 kD的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子。P13K/Akt信號通路是細胞存活密切相關(guān)的重要信號通路，神經(jīng)保護作用與激活P13K/Akt信號通路相關(guān)［8］。研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動脈栓塞大鼠梗死中心區(qū)僅有微量的PI3K、AKt表達，而在缺血灶周圍則有大量PI3K及磷酸化的AKt表達，證明PI3K/AKt信號通路不僅參與了腦缺血的病理生理過程，而且與腦損傷的程度密切相關(guān)［9］。caspase是一組天門冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶（cysteinpmlease），caspase家族是一大類凋亡調(diào)節(jié)基因，是哺乳動物細胞凋亡的啟動和執(zhí)行者，而caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一。caspase-3是多種凋亡途徑最主要的下游效應(yīng)因子之一，是細胞凋亡公認的關(guān)鍵酶。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性神經(jīng)損傷過程中，抑制caspase-3活性可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護作用［10］。

本實驗結(jié)果表明，缺血缺氧性腦損傷幼鼠腦組織PI3K及AKt表達較D組及E組明顯降低，Caspase-3表達及神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量明顯增加。朱璉針刺興奮法針刺干預(yù)后各項指標雖未達正常水平，但較C組已有顯著改善，提示朱璉針刺興奮法針刺干預(yù)不僅能下調(diào)缺血缺氧性腦損傷幼鼠Caspase-3表達，而且能提高PI3K及AKt活性，抑制神經(jīng)細胞凋亡，改善腦神經(jīng)功能，且早期介入作用更明顯。由此可見，朱璉針刺興奮法對缺血缺氧性腦損傷幼鼠的神經(jīng)保護作用的主要機制可能是通過激活幼鼠腦組織的PI3K/AKt信號通路，抑制Caspase-3蛋白表達，從而抑制細胞凋亡，促進神經(jīng)細胞的功能代謝，重建神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。

參考文獻

［1］中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會神經(jīng)學(xué)組.小兒腦性癱瘓的定義、診斷條件及分型［J］.中華兒科雜志，2005，43（4）：262.

［2］Kamada H，Nito C，Endo H，et al.Bad as a converging signaling molecule between survival PI3-K/Akt and death JNK in neurons after transient focal cerebral ischemia in rats［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2007，27（3）：521-533.

［3］Holtzman DM，Shelodon RA，Jaffe W，et al.Nerve growth factor protects the neonatal brain against hypoxic-ischemic injury［J］.Ann Neurol，1996，39（1）：114-122.

［4］張露芬.實驗針灸學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社出，2010：219.

［5］朱璉.新針灸學(xué)［M］.南寧：廣西人民出版社，1980：17.

［6］韋立富，潘小霞，劉兵，等.朱璉針灸臨床特色與經(jīng)驗［J］.中國針灸，2015，35（1）：94-97.

［7］韋立富，岳進，潘小霞.現(xiàn)代針灸學(xué)家朱璉學(xué)術(shù)思想簡介［J］.中國針灸，2008，28（9）：667-671.

［8］聶瑩雪，劉華巖，翟志勇.大鼠腦缺血再灌注后海馬組織PI3-K信號通路的變化［J］.中國老年學(xué)雜志，2007，27（10）：943-944

［9］許藝超，石松生.PI3K/AKt信號通路在腦缺血神經(jīng)元凋亡中作用的研究進展［J］.國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科雜志，2012，39（6）：530-533.

［10］Kitagawa H，Warita H，Sasaki C，et al.Immunoreactive Akt，PI3-K andERKproteinkinaseexpressioninischemicratbrain［J］. Neurosci Lett，1999，274（1）：45-48.

【中圖分類號】R2-03

【文獻標志碼】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.05.0592

文章編號：1005-0957（2016）05-0592-04

收稿日期2016-01-11

基金項目：廣西衛(wèi)計委中醫(yī)藥科技專項公關(guān)課題（GZGG13-11）

作者簡介：陳明明（1984-），女，主治醫(yī)師

通信作者：潘小霞（1964-），女，主任醫(yī)師，Email：echenpxx@163.com

Effect of Zhu Lian Acupuncture Exciting Method on Nerve Cell Apoptosis and the Expressions of PI3K，AKt and Caspase-3 Proteins in Young Rats with Hypoxic-ischemic Brain Damage

CHEN Ming-ming1，PAN Xiao-xia1，ZHENG Fa-wen2，CHEN Li-rong1，LI Yan-jing3，F(xiàn)AN Jian-hua3，WEI Li-fu1.
1.Nanning Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine，Nanning 530012，China；2.Nanning First People's Hospital，Nanning 530021，China；3.Guangxi Academy of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530022，China

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of different time intervention of Zhu Lian acupuncture exciting method on nerve cell apoptosis and tissue expressions of PI3K（phosphatidylinositol 3-kinase），AKt（serine/threonine kinase）and Caspase-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3）proteins in young rats with hypoxic-ischemic brain damage.MethodsFifty 7-day-old rats were randomized into groups A（acupuncture exciting methodⅠ），B（acupuncture exciting methodⅡ），C（model），D（sham operation）and E（normal control），10 rats each.Groups A and E began to receive acupuncture in 24 hours after model making and group B，at 8 days after model making.Groups C and D were not given acupuncture.Every group of animals was sacrificed at 21 days after model making.Nerve cell apoptosis was examined using In situ end labeling（TUNEL）technique.Cerebral expressions of PI3K，AKt and Caspase-3 proteins were determined by immunohistochemical method.ResultsThe number of apoptotic cells was significantly smaller in groups A and B than in group C（P＜0.01，P＜0.05）and decreased significantly in group A compared with group B（P＜0.05）.The expressions of PI3K and AKt proteins increased significantly and the expression of Caspase-3 protein decreased significantly in groups A and B compared with group C；there were statistically significant differences（P＜0.01，P＜0.05）. PI3K expression increased significantly and Caspase-3 protein expression decreased significantly in group A compared with group B （P＜0.05）；there were statistically significant differences（P＜0.05）.ConclusionsZhu Lian acupuncture exciting method can inhibit nerve cell apoptosis，stimulate the expression of PI3K/AKt signaling pathway，increase PI3K and AKt activities and reduce the expression of Caspase-3 protein in young rats with hypoxic-ischemic brain damage.Early intervention of Zhu Lian acupuncture exciting method is of important significance in producing a protective effect on brain nerves in young rats with hypoxic-ischemic brain damage.

［Key words］Acupuncture therapy；Zhu Lian acupuncture exciting method；Brain damage；Young rats；Apoptosis；PI3K；AKt；Caspase-3