李晶晶，張英，眭明紅，黃泰錚，裴文婭，林國華（.廣州中醫(yī)藥大學附屬寶安中醫(yī)院，深圳 58；.玉溪市人民醫(yī)院，玉溪 6500；.中山大學附屬第二醫(yī)院，廣州 500；.廣州中醫(yī)藥大學，廣州 5005）

?

·動物實驗·

火針對類風濕關節(jié)炎大鼠痛閾及IL-1、TNF-α的影響

李晶晶1，張英2，眭明紅3，黃泰錚4，裴文婭4，林國華4
（1.廣州中醫(yī)藥大學附屬寶安中醫(yī)院，深圳 518133；2.玉溪市人民醫(yī)院，玉溪 653100；3.中山大學附屬第二醫(yī)院，廣州 510210；4.廣州中醫(yī)藥大學，廣州 510405）

【摘要】目的比較火針、普通針刺及穴位埋線對類風濕關節(jié)炎大鼠的鎮(zhèn)痛效應。方法將50只健康雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、針刺組、火針組和穴位埋線組，每組10只。以完全弗氏佐劑（CFA）注入SD大鼠右后足墊皮膚內制作類風濕關節(jié)炎模型，3組均取右側昆侖、足三里作為治療穴位，分別行火針、針刺、穴位埋線治療，分別于造模前1 d、造模第4天及治療1、7、14 d后測定閾值，以各組大鼠右側縮腿的機械足反射閾值（MWT）和熱刺激爪退縮閾值（TWL）作為觀測指標。治療結束后分離大鼠足炎癥組織，檢測其中IL-1、TNF-α的含量。結果模型組、針刺組、穴位埋線組和火針組造模后及治療1、7、14 d后MWT和TWL指標與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）?；疳樈M治療1、7、14 d后MWT和TWL指標與模型組、針刺組和穴位埋線組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。針刺組和穴位埋線組治療1、7、14 d后MWT指標與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。針刺組和穴位埋線組治療7、14 d后TWL指標與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。模型組、針刺組、穴位埋線組和火針組大鼠造模后IL-1和TNF-α含量與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。針刺組、穴位埋線組和火針組大鼠治療后IL-1和TNF-α含量與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。針刺組和穴位埋線組大鼠治療后IL-1和TNF-α含量與火針組比較，差均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論火針能夠提高類風濕關節(jié)炎大鼠痛閾，并通過降低病變肌肉組織中炎癥因子含量，從而減輕類風濕關節(jié)炎引起的慢性疼痛。

【關鍵詞】火針；穴位埋線；針刺；鎮(zhèn)痛；關節(jié)炎，類風濕；血清白介素-1；腫瘤壞死因子；大鼠

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節(jié)滑膜炎為特征的全身性免疫性疾病?；ぱ追磸桶l(fā)作會導致關節(jié)內軟骨的破壞，產生關節(jié)功能障礙，嚴重者甚至會導致不同程度的殘廢，是臨床中最常見的病癥之一。由于本病病程遷延，發(fā)病緩慢，倘若不給予及時的治療容易引起關節(jié)畸形或者功能性障礙，更有甚者導致殘疾，嚴重影響患者身體健康和生活質量［1］。

為進一步探討RA炎性痛應激的發(fā)病機理及有效的治療方法，本實驗采用佐劑性關節(jié)炎模型作為RA模型，從疼痛行為學角度來觀察普通針刺、火針、穴位埋線對模型大鼠行為學及炎癥因子的影響，現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物

50只健康成年SD大鼠，雄性，SPF級，體重（200± 20）g，1.5月齡，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供［許可證號SCXK（粵）2008-0002，NO44007200006565］。動物在實驗前適應性喂養(yǎng)1星期，飼養(yǎng)室及行為學實驗室溫度維持在（20±1）℃，濕度約為50%。隨機分為對照組、模型組、針刺組、穴位埋線組和火針組，每組10只。行為學實驗均在9：00—18：30進行。

1.2實驗儀器及試劑

完全弗氏佐劑F5881（美國Sigma公司）；電子測痛儀（美國IITC Life Science公司）；Almemo2450型數據采集器（德國AHLBORN公司）；泰盟PL-200型熱刺痛儀（成都泰盟科技有限公司）；IL-1、TNF-α試劑盒（廣州格瑞林生物科技有限公司）；TG12M離心機（鹽城凱特）；－80℃冰箱（日本三洋）；AE-200型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；酶標儀（美國Thermo）；長15～40 mm不銹鋼針灸針（蘇州天協(xié)針灸器械有限公司）；賀氏火針（定制）；6號一次性使用無菌注射針（浙江京環(huán)醫(yī)療用品有限公司）；3-0無菌醫(yī)用羊腸線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司）。

1.3模型制備

模型組、針刺組、火針組、穴位埋線組大鼠采用5%水合氯醛（0.8 mL/100 g）腹腔麻醉后，于大鼠右后足跖底部常規(guī)皮膚消毒，用微量注射器皮內進針至踝關節(jié)，注射完全弗氏佐劑0.1 mL致炎。觀察3 d，以24 h出現右側足部急性炎癥腫脹，48 h出現繼發(fā)性全身多發(fā)性關節(jié)炎，表現為前肢或對側肢體甚至耳、尾部紅腫或炎癥結節(jié)出現，此時即為造模成功。

1.4治療方法

1.4.1對照組

不造模，不治療。

1.4.2模型組

只造模，不治療。

1.4.3火針組

造模第4天將大鼠俯臥位于束鼠器中固定，外展拉直右側后肢后，進行右腿部剃毛處理。取右側足三里和昆侖穴。足三里位于右側膝關節(jié)后外側，在腓骨小頭下約0.5 mm處；右昆侖位于右側后肢外踝與跟腱之間的凹陷中，上述穴位參照林文注主編《實驗針灸學》［2］大鼠標準穴位圖譜定位。局部皮膚常規(guī)消毒后，用碘伏棉棒在穴位處標記，施術者右手持火針，置于乙醇燈外焰燒灼，待針尖燒至白亮后，快速點刺足三里和昆侖穴，速進速出，每穴點刺3下。隔日1次，共治療7次。

1.4.4針刺組

造模第4天將大鼠俯臥位于束鼠器中固定，外展拉直右側后肢后，進行右腿部剃毛處理。局部皮膚常規(guī)消毒后，用碘伏棉棒在穴位處標記，用長13 mm毫針迅速刺入大鼠足三里和昆侖穴0.3寸，留針30 min后出針。隔日1次，共治療7次。

1.4.5穴位埋線組

造模第4天將大鼠俯臥位于束鼠器中固定，外展拉直右側后肢后，進行右腿部剃毛處理后。局部皮膚常規(guī)消毒后，用碘伏棉棒在穴位處標記，將已預先置入長0.5 cm無菌羊腸線的6號針頭快速刺入，待羊腸線完全置入穴位后退針。每6 d治療1次，共治療2次。

1.5觀察指標

1.5.1痛敏閾值測定

采用機械測痛法與熱輻射測痛法［3］分別于造模前1 d、造模第4天及治療1、7、14 d后測痛敏閾值。

1.5.1.1機械測痛法

采用電子測痛儀（IITC Life Science），將大鼠放入有機玻璃箱內，待其適應30 min后，通過反光鏡將觸針對準大鼠后足掌面，觸針自金屬篩網下部持續(xù)垂直刺激大鼠后肢足底中部，大鼠出現縮足或舔足行為時視為陽性反應，刺激強度隨即顯示在數據采集器屏幕上即為機械縮爪閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT），每次間隔5 min，共測5次，去掉最大值和最小值后取平均值。

1.5.1.2熱輻射測痛法

采用PL-200型熱刺痛儀測定大鼠的縮爪潛伏期。將大鼠放入熱刺痛儀的有機玻璃格子內待其適應一段時間靜止休息時，將強度為50%的光輻射焦點對準大鼠足底中部，以大鼠抬腿的潛伏期作為熱刺激爪退縮閾值（thermal withdrawal lateney，TWL），連續(xù)測5次，間隔5～10 min，去掉最大值和最小值后取其平均值，為防止熱輻射損傷，光照最長時限定為30 s。

1.5.2IL-1和TNF-α含量測定

在行為學實驗結束后2～3 d，將各組大鼠用5%水合氯醛（0.8 mL/100 g）腹腔注射麻醉，切割炎癥病變組織標本后，稱取重量。加入一定量的PBS（pH值為7.4），用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?～8℃的溫度，再加入一定量的PBS（pH值為7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分，離心約20 min（2000～3000 轉/min）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余置于-20℃冷凍備用。采用雙抗夾心ELISA法檢測大鼠肌肉組織IL-1和TNF-α。

1.6統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，然后進行LSD檢驗，組內前后差異采用t檢驗，計量資料以均數±標準差表示。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　實驗結果

2.1各組大鼠不同時間MWT指標比較

由表1、圖1可見，各組造模前MWT指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。模型組、針刺組、穴位埋線組和火針組造模后及治療1、7、14 d后MWT指標與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。針刺組、穴位埋線組和火針組治療1、7、14 d后MWT指標與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）?；疳樈M治療1、7、14 d后MWT指標與針刺組和穴位埋線組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表1　各組大鼠不同時間MWT指標比較（±s,g）

表1　各組大鼠不同時間MWT指標比較（±s,g）

注：與對照組比較1）P＜0.01；與模型組比較2）P＜0.01；與針刺組比較3）P＜0.01；與穴位埋線組比較4）P＜0.01

組別　n　造模前　造模后　治療1 d后　治療7 d后　治療14 d后對照組　10　34.63±2.86　35.00±1.88　34.94±2.55　35.29±3.02　36.77±3.4模型組　10　34.81±3.14　16.78±2.711）　16.22±2.291）　16.74±2.191）　17.36±2.061）針刺組　10　35.47±2.49　18.16±2.811）　20.78±2.461）2）　22.83±2.941）2）　24.02±3.851）2）穴位埋線組　10　34.47±2.94　17.04±3.171）　17.90±3.201）3）　23.39±2.201）2）　24.39±2.611）2）火針組　10　34.30±2.00　18.33±3.391）　23.47±2.881）2）3）4）　28.74±1.201）2）3）4）　28.94±1.371）2）3）4）

2.2各組大鼠不同時間TWL指標比較

由表2、圖2可見，模型組、針刺組和穴位埋線組造模后及治療1、7、14 d后TWL指標與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）?；疳樈M造模后及治療1、 7 d后TWL指標與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）?；疳樈M治療1、7、14 d后TWL指標與模型組、針刺組和穴位埋線組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。針刺組和穴位埋線組治療7、14 d 后TWL指標與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。

圖2　各組大鼠不同時間TWL指標比較

表2　各組大鼠熱刺激爪退縮閾值（TWL）比較?。▁±s,s）

2.3各組大鼠肌肉病變組織IL-1和TNF-α含量比較

由表3、圖3可見，模型組、針刺組、穴位埋線組大鼠IL-1和TNF-α含量與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；火針組TNF-α含量與對照組接近（P＞0.05）。針刺組、穴位埋線組和火針組大鼠治療后IL-1和TNF-α含量與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。針刺組和穴位埋線組大鼠治療后TNF-α含量與火針組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。針刺組和穴位埋線組大鼠治療后IL-1含量與火針組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖3　各組大鼠肌肉病變組織IL-1和TNF-α含量比較

表3　各組肌肉病變組織IL-1和TNF-α含量比較?。ā纒）

表3　各組肌肉病變組織IL-1和TNF-α含量比較?。ā纒）

注：與對照組比較1）P＜0.01；與模型組比較2）P＜0.01，；與針刺組比較3）P＜0.05；與穴位埋線組比較4）P＜0.05

組別　n　TNF-α　IL-1對照組　10　16.44±3.48　13.56±1.85模型組　10　31.09±4.681）　32.69±2.041）針刺組　10　21.97±2.141）2）　21.82±1.921）2）穴位埋線組　10　22.31±2.081）2）　20.14±2.721）2）火針組　10　17.82±5.132）3）4）　19.91±2.621）2）

3　討論

類風濕關節(jié)炎是一種以關節(jié)滑膜炎為特征的全身性免疫性疾病。慢性痛是其主要臨床表現之一，疼痛甚者會影響患者情緒，誘發(fā)焦慮癥狀，嚴重影響RA患者的生活質量［4］。目前治療RA的首選藥物以甲氨蝶呤為主，它的作用機制是抑制RA滑膜細胞增殖，阻止滑膜組織對周圍的侵蝕，從而起到治療作用。有實驗研究［5］表明，甲氨蝶呤會引起肝細胞核增大、變形，并產生骨髓抑制，對肝臟和免疫系統(tǒng)有較嚴重的不良反應。而針灸作為一種鎮(zhèn)痛效果明顯且副反應小的治療方式，已得到廣泛的認可。

目前國內對RA研究的動物模型，主要以佐劑性關節(jié)炎大鼠（AA）模型為主，其被認可為一種典型的慢性炎癥疼痛模型［6］。完全弗氏佐劑CFA能成功誘導大鼠AA模型，為研究RA的發(fā)病機制及藥物療效提供理想的實驗模型。造模后第1天，大鼠TWL明顯縮短，表現為痛敏。造模后第4天痛敏穩(wěn)定，可持續(xù)4星期以上。

長期臨床實踐表明，針刺療法不僅能夠治療急性疼痛，而且多次針刺還能產生累加效應，從而治療多種慢性疼痛［7］。從某種意義上講，針刺的本質是破壞組織引起疼痛的損傷性刺激。目前，對單純針刺及電針治療的鎮(zhèn)痛機理研究較多，而對于火針鎮(zhèn)痛的機制研究卻十分匱乏。因此，本研究利用火針療法對RA模型大鼠進行治療和研究，旨在對火針的鎮(zhèn)痛療效進行深入探索。

火針集毫針激發(fā)經氣、火氣溫陽散寒的功效于一體，通過借火助陽、溫通經絡、開門驅邪、以熱引熱等機制起作用。借火助陽是其根本，正是由于火，才有了開門、引熱等功能。故火針的作用可歸納為溫陽散寒，化氣利水；溫經通絡，祛瘀止痛；補養(yǎng)氣血，升陽舉陷；清熱解毒，引邪外達；消癥散結，生肌斂瘡等方面［8］。

行為學實驗結果顯示，大鼠造模后患足MWT、TWL指標降低，普通針刺、穴位埋線和火針治療均能夠有效提高大鼠痛閾?；疳樈M治療1、7、14 d后MWT和TWL指標與針刺組和穴位埋線組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05），提示火針的鎮(zhèn)痛效應優(yōu)于其他兩組，并且具有起效快、療效高、維持時間長等優(yōu)勢。

IL-1和TNF-α作為炎癥因子在RA發(fā)病過程中起著重要的協(xié)同效應，具有致熱源和致炎作用，兩者可刺激血管內皮細胞合成PGE2，刺激下丘腦體溫調節(jié)中樞引起發(fā)熱；誘導急性期反應，刺激滑膜細胞浸潤，血管增生，血管翳形成，加速軟骨破壞和纖維組織增生。因此，降低IL-1和TNF-α是治療RA的重要環(huán)節(jié)之一。本研究表明，造模后大鼠病變組織IL-1和TNF-α含量明顯升高，而火針、針刺、穴位埋線均能降低大鼠病變組織TNF-α及IL-1含量，其中火針的效果更顯著，能夠有效消除引起局部炎癥及趨化作用的因素，從而改善RA紅、腫、熱、痛等臨床癥狀，增強機體免疫的功能。

研究表明，火針改善RA病理情況主要通過以下環(huán)節(jié)。①降低體內炎癥因子?；疳樛ㄟ^降低體內炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-1β、TNF-α的發(fā)生趨化，阻斷炎癥因子介導的免疫反應，滑膜細胞及炎癥細胞浸潤相應減少［9-11］。②調節(jié)神經遞質含量。通過調節(jié)外周、中樞的神經遞質，如升高動物腦內（端腦與間腦）5-HT含量，降低外周組織中NE（血漿中NE主要來自交感神經末梢，NE本身不是致痛物質，但疼痛伴有一系列自主神經反應，尤其是交感神經活動亢進）、5-HT、5-HIAA、HA、腺苷等疼痛物質含量，從而達到中樞與外周共同作用的鎮(zhèn)痛效應。③興奮“第二優(yōu)勢灶”。即火針刺激在中樞形成第二興奮灶強度超過原有病灶在中樞形成的第一興奮灶，第一個興奮灶的興奮被抑制并被牽引至另一處。④提高刺激反射閾值。當內臟存在病變時，由刺激感受性低的內臟通過大腦皮層向刺激感受性高的相應脊髓神經所支配的皮膚形成刺激反射，即人們常稱的“海特帶”，通過刺激與內臟原發(fā)病灶相應脊髓節(jié)段的皮膚，由于皮膚的刺激感受性比內臟要高，因此，火針引起的皮膚疼痛必然影響內臟病變刺激所引起的疼痛向中樞的傳達，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應。

足三里為胃經經穴，具有疏通經脈、調氣和血、健脾益氣、扶正祛邪等功效。昆侖為足太陽膀胱經經穴，具有消腫止痛、強壯腰腿的功能。研究表明，足三里和昆侖穴對神經-內分泌-免疫網絡均具有良好的調整作用，可在不同水平調節(jié)相關免疫、抗炎物質的合成、釋放，并通過共同的介質實現對神經-內分泌-免疫網絡的整體調節(jié)，從而發(fā)揮調節(jié)機體免疫功能、消炎鎮(zhèn)痛，調節(jié)神經系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)功能的紊亂，提高機體抗病及應激能力［12］?；疳橖c刺足三里和昆侖穴可以促進關節(jié)局部的血液循環(huán)，改善血液供應，放松局部肌肉，減輕滑膜的炎癥性反應，從而達到緩解疼痛的作用。

綜上所述，本實驗證實了火針能夠有效地消炎鎮(zhèn)痛，且鎮(zhèn)痛效果明顯，維持時間長。但今后應從多方面、多角度、深層次探討剖析火針對RA的治療與鎮(zhèn)痛機理，尤其可從神經-免疫-內分泌網絡綜合調節(jié)的角度進行研究，旨在闡明火針治療RA的機制，以便更好地拓展火針鎮(zhèn)痛的機理，為臨床利用火針治療RA提供更具說服力的科學依據。

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【中圖分類號】R2-03

【文獻標志碼】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.05.0583

文章編號：1005-0957（2016）05-0583-05

收稿日期2015-08-17

作者簡介：李晶晶（1985-），女，醫(yī)師，2012級博士生

通信作者：林國華（1964-），男，教授，研究方向為針灸鎮(zhèn)痛研究，Email：tcmlin-801@163.com

Experimental Study of the Effect of Fire Needling on Pain Threshold，and IL-1 and TNF-α in Rheumatoid Arthritis Rats

LI Jing-jing1，ZHANG Ying2，SUI Ming-hong3，HUANG Tai-zheng4，PEI Wen-ya4，LIN Guo-hua4.
1.Bao'an Traditional Chinese Medicine Hospital，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Shenzhen 518133，China；2.Yuxi People's Hospital，Yuxi 653100，China；3.Zhongshan University Second Hospital，Guangzhou 510210，China；4.Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China

［Abstract］ObjectiveTo compare the analgesic effects of fire needling，conventional acupuncture and acupoint catgut embedding in rats with rheumatoid arthritis.MethodsFifty healthy male SD rats were randomized into control，model，acupuncture，fire needling and catgut embedding groups，10 rats each.A SD rat model of rheumatoid arthritis was made by intracutaneous injection of complete Freund's adjuvant into the right hind foot pad.Right Kunlun and Zusanli were selected as therapeutic points in the three groups and given fire needling，acupuncture or catgut embedding.The right paw mechanical withdrawal threshold（MWT）and thermal withdrawal latency（TWL）were used as observation indices and measured in every group of rats at one day before and four days after model making and at one，seven and fourteen days after the beginning of treatment.Rat paw inflammatory tissues were separated after the completion of treatment.The IL-1 and TNF-α contents of them were measured.ResultsThere were statistically significant differences in MWT and TWL between the model，acupuncture，fire needling or catgut embedding group and the control group after model making，and one，seven and fourteen days of treatment（P＜0.01）.There were statistically significant differences in MWT and TWL between the fire needling group and the model，acupuncture or catgut embedding group after one，seven and fourteen days of treatment（P＜0.01，P＜0.05）.There was a statistically significant difference in MWT between the acupuncture or catgut embedding group and the model group after one，seven and fourteen days of treatment（P＜0.01）.There was a statistically significant difference in TWL between the acupuncture or catgut embedding group and the model group after seven and fourteen days of treatment（P＜0.01，P＜0.05）.There were statistically significant differences in IL-1 and TNF-α contents between the model，acupuncture，catgut embedding or fire needling group and the control group after model making（P＜0.01）.after treatment，there were statistically significant differences in IL-1 and TNF-α contents between the acupuncture，catgut embedding or fire needling group and the model group and between the acupuncture or catgut embedding group and the fire needling group（P＜0.05）. ConclusionsFire needling can raise pain threshold in rats with rheumatoid arthritis.It alleviates rheumatoid arthritis-induced chronic pain by reducing the inflammatory factor content of affected muscular tissues.

［Key words］Fire needling；Acupoint catgut embedding；Acupuncture；Analgesia；Rheumatoid arthritis；Serum interleukin-1；Tumor necrosis factor；Rats