劉　瑩，劉金濤，高轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，汪　婧，江　峰

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院　1.超聲醫(yī)學(xué)科；2.麻醉科，安徽　蕪湖　241001)

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·臨床醫(yī)學(xué)·

PDGF-BB在Graves病患者外周血中的表達(dá)及意義

劉瑩1，劉金濤2，高轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)1，汪婧1，江峰1

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院1.超聲醫(yī)學(xué)科；2.麻醉科，安徽蕪湖241001)

【摘要】目的：檢測(cè)PDGF-BB在Graves病患者外周血中的表達(dá)，探討PDGF在Graves病進(jìn)展中的作用和機(jī)制。方法：收集Graves病患者外周血樣本41例以及健康人群外周血樣本41例。ELISA法檢測(cè)PDGF-BB、HIF-1α的濃度；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組外周血樣本中單核巨噬細(xì)胞CCR2的表達(dá)。結(jié)果：PDGF-BB、HIF-1α在Graves病患者和健康人群外周血中均有表達(dá)。與健康對(duì)照組相比，PDGF-BB、HIF-1α在Graves病患者血清中的濃度增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，Graves病患者外周血中CCR2陽(yáng)性巨噬細(xì)胞的比例高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：Graves病患者體內(nèi)CCR2巨噬細(xì)胞可能通過(guò)HIF-1α途徑促進(jìn)PDGF-BB的表達(dá)，而PDGF-BB的高表達(dá)則可能是引起Graves病進(jìn)展的重要參與因素。

【關(guān)鍵詞】血小板衍生生長(zhǎng)因子；Graves?。痪奘杉?xì)胞；免疫

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.04.013

Graves病(graves′ disease，GD)屬于自身免疫性疾病，目前針對(duì)該疾病的研究主要聚焦于其免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。血小板衍生生長(zhǎng)因子 (platelet-derived growth factor,PDGF) 屬于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族，其中PDGF-BB是PDGF家族中類似VEGF的分子[1]，具有極強(qiáng)的促纖維化、促平滑肌生長(zhǎng)以及促血管新生的能力[2]。研究發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB可能參與到Graves病發(fā)病的病理過(guò)程[3]，但PDGF-BB在Graves病患者外周血的表達(dá)情況鮮見(jiàn)報(bào)道。因此本研究選擇Graves病患者為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定其血清中PDGF-BB的表達(dá)含量以及其可能的誘導(dǎo)因素，探討Graves病與PDGF-BB在外周血中表達(dá)的相關(guān)性，為Graves病的防治提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象2013年10月～2015年6月由超聲科初診并經(jīng)內(nèi)分泌科確診的Graves病初發(fā)住院患者41例，其中女性24人，男性17人，平均年齡(34±12.6)歲。健康人群樣本來(lái)自本院體檢中心41例，女性27人，男性14人，平均年齡(36±10.3)歲。兩組間年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Graves 病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：①臨床甲亢癥狀和體征；②甲狀腺?gòu)浡阅[大(經(jīng)臨床觸診和高頻淺表超聲證實(shí))，少數(shù)病例可以無(wú)腫大；③血清TSH降低，甲狀腺激素升高；④眼球突出和其他浸潤(rùn)性眼征；⑤脛前黏液性水腫；⑥TRAb或TSAb陽(yáng)性。以上標(biāo)準(zhǔn)中，①～③項(xiàng)為診斷必備條件，④～⑥項(xiàng)為診斷輔助條件。

1.2主要試劑小牛血清(calf serum,CS)、PBS緩沖液購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；PDGF-BB以及HIF-1α ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；PE標(biāo)記兔抗人CCR2、FITC標(biāo)記兔抗人CD68抗體以及同型對(duì)照抗體IgG購(gòu)自美國(guó)BD公司；溶血?jiǎng)┵?gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3主要儀器百勝M(fèi)ylab90型超聲儀；Beckman FC500型流式細(xì)胞儀；酶標(biāo)儀；離心機(jī)。

1.4方法

1.4.1彩超診斷Graves病采用百勝M(fèi)ylab90型超聲儀，高頻線陣探頭，頻率8～13 MHz。患者取仰臥位，充分暴露檢查區(qū)域，進(jìn)行縱切面、橫切面檢查。彩超觀察甲狀腺大小、形態(tài)、回聲特點(diǎn)、血流信號(hào)及周圍組織情況，取標(biāo)準(zhǔn)切面分別測(cè)量左右葉前后徑、上下徑、左右徑，峽部厚度，以及甲狀腺上動(dòng)脈收縮期峰值流速PSV、阻力指數(shù)RI。

1.4.2外周血樣本的采集用抗凝管收集患者外周血樣本約2 mL。1800 r/min、4 ℃離心5 min，用移液器收集上層澄清的血清，-80 ℃低溫保存，用于后續(xù)的ELISA實(shí)驗(yàn)。抗凝管中剩余的血細(xì)胞經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理10 min。加入1 mL蒸餾水混勻，1800 r/min，常溫下離心5 min，紅細(xì)胞發(fā)生裂解，溶于蒸餾水中。倒出蒸餾水，獲取的細(xì)胞沉淀為混合的單個(gè)核細(xì)胞，用于后續(xù)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.4.3ELISA法測(cè)定外周血血清中PDGF-BB以及HIF-1α的表達(dá)外周血血清樣本的檢測(cè)按R&D公司ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。操作完成后，ELISA檢測(cè)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的吸光度(A450)值。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的制定，計(jì)算各個(gè)樣本A450值所對(duì)應(yīng)的濃度值。

1.4.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單核巨噬細(xì)胞CCR2的表達(dá)外周血樣本經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理10 min，1800 r/min、4 ℃離心5 min，清除破碎的紅細(xì)胞。將細(xì)胞調(diào)成2×105/mL濃度的細(xì)胞懸液，每個(gè)試驗(yàn)反應(yīng)細(xì)胞數(shù)為5×104；將一份標(biāo)本分成2份(其中1份作為同型對(duì)照)，細(xì)胞懸液中加入目標(biāo)抗體CD68以及CCR2，4 ℃避光反應(yīng)30 min。同型對(duì)照組加入兔IgG同型對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，PBS離心洗滌，制備成懸液上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1受試者臨床基本情況41例Graves病患者均有心動(dòng)過(guò)速、心悸、食欲亢進(jìn)等高代謝綜合征。甲狀腺明顯腫大。有37例患者出現(xiàn)了不同程度的突眼，發(fā)生率90.2 %，其中1例為浸潤(rùn)性，發(fā)生率2.4 %。患者血游離T3、T4均高于正常值，其中7例明顯增高，>30.80 pmol/L。41例中促甲狀腺激素受體刺激性抗體(TSAb)陽(yáng)性率為95%。健康對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)均正常。

2.2患者超聲檢查結(jié)果二維超聲顯示，Graves病組患者甲狀腺體積明顯增大(峽部一般無(wú)明顯增厚)，形態(tài)飽滿，包膜完整，邊界清晰，回聲增強(qiáng)，分布均勻。彩色多普勒示甲狀腺腺體內(nèi)血流豐富，血流信號(hào)明顯增多且呈搏動(dòng)閃爍亮點(diǎn)“火海征”(圖1A)。甲狀腺上動(dòng)脈擴(kuò)張(正常內(nèi)徑<2 mm)，脈沖多普勒可探及高速低阻湍流頻譜(圖1B)。

圖1Graves病患者甲狀腺彩色多普勒及脈沖多普勒超聲聲像圖表現(xiàn)

2.3外周血中PDGF-BB以及HIF-1α的表達(dá)ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，Graves病組患者外周血血清中PDGF-BB及HIF-1α的濃度分別為(189.16±22.37)pg/mL、(239.69±32.97)pg/mL；健康對(duì)照組血清中PDGF-BB及HIF-1α的濃度分別為(121.12±29.38)pg/mL、(106.45±44.39)pg/mL。Graves病組PDGF-BB、HIF-1α濃度明顯高于對(duì)照組，對(duì)應(yīng)t值分別為3.696、3.651，P值分別為0.021、0.022，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。統(tǒng)計(jì)顯示，T3值最高的7例患者血清中PDGF-BB以及HIF-1α的濃度為(241.35±51.22)pg/mL、(287.32±37.46)pg/mL，高于Graves病患者血清的平均值。分別對(duì)PDGF-BB、HIF-1α濃度進(jìn)行組內(nèi)比較，與其他34例Graves病比較，t值分別為3.374、3.640，P值分別為0.028、0.022，7例患者血清中PDGF-BB以及HIF-1α的濃度升高趨勢(shì)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。

2.4外周血中單核巨噬細(xì)胞CCR2的表達(dá)通過(guò)對(duì)41例Graves病組患者以及健康對(duì)照組各外周血樣本的流式檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD68的表達(dá)比例達(dá)到(13.19±4.55)%，陽(yáng)性細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞。以CD68的陽(yáng)性率設(shè)門(mén)，檢測(cè)CCR2的表達(dá)。結(jié)果顯示：健康對(duì)照組CCR2的陽(yáng)性率為(41.21±11.26)% (圖2a)，Graves病組患者CCR2的表達(dá)率為(55.25±10.44)% (圖2b)。Graves病組CCR2的表達(dá)高于對(duì)照組，t值為3.280，P值為0.031，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)(圖2d)。統(tǒng)計(jì)顯示，T3值最高的7例患者外周血中CCR2的表達(dá)為(62.16±9.85)% (圖2c)，高于Graves病患者的平均值。進(jìn)行組內(nèi)統(tǒng)計(jì)，與其他34例Graves病比較，t值為2.921，P值為0.043，7例患者外周血中CCR2的表達(dá)的升高趨勢(shì)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)(圖2e)。

a：正常對(duì)照組，b：Graves病組，c：Graves病較重組；FL1 Log為FITC(異硫氰酸熒光素)熒光通道，F(xiàn)L2 Log為PE(藻紅蛋白)熒光通道；a、b、c中紅色圈B內(nèi)為陽(yáng)性巨噬細(xì)胞，C的百分比為CCR2的陽(yáng)性表達(dá)值；d、e中A表示兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2外周血中陽(yáng)性巨噬細(xì)胞CCR2表達(dá)的測(cè)定

2.5PDGF-BB與陽(yáng)性巨噬細(xì)胞CCR2表達(dá)的相關(guān)性檢驗(yàn)本研究對(duì)Graves病組患者以及健康對(duì)照組的PDGF-BB表達(dá)值與陽(yáng)性巨噬細(xì)胞CCR2表達(dá)值進(jìn)行了相關(guān)性分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示r2值為0.5777(圖3)，提示PDGF-BB表達(dá)與陽(yáng)性巨噬細(xì)胞CCR2表達(dá)呈正相關(guān)。

3討論

本文研究PDGF-BB在Graves患者外周血的表達(dá)情況，同時(shí)分析其表達(dá)變化的可能機(jī)制，證實(shí)PDGF-BB在Graves患者外周血中表達(dá)呈升高趨勢(shì)，其升高水平可能與外周血內(nèi)HIF-1α的升高引起CCR2陽(yáng)性巨噬細(xì)胞增生活躍、促進(jìn)VEGF、PDGF-BB分泌等作用相關(guān)。目前分子靶向治療是臨床控制疾病發(fā)展的重要手段。PDGF-BB分子在Graves患者外周血中的異常表達(dá)，為臨床以PDGF-BB為分子靶點(diǎn)，通過(guò)阻抑其分子信號(hào)通路，達(dá)到有效控制疾病的治療方法提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖3PDGF-BB表達(dá)與陽(yáng)性巨噬細(xì)胞CCR2表達(dá)的相關(guān)性

Graves病是臨床上較難根治的疾病之一，其重要表現(xiàn)是甲亢。甲亢能加劇機(jī)體的免疫紊亂，免疫調(diào)節(jié)紊亂又能反過(guò)來(lái)加重甲狀腺毒癥，形成惡性循環(huán)[5]。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)PDGF-BB參與Graves病的發(fā)病過(guò)程[6]，研究數(shù)據(jù)分析得出，PDGF-BB可被視為Graves病尤其是Graves眼病病理生理過(guò)程的重要調(diào)控因子。但PDGF-BB在患者外周血中表達(dá)情況以及其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。因此，本試驗(yàn)首先檢測(cè)了PDGF-BB在患者外周血中的表達(dá)情況，與對(duì)照組比較，Graves病患者外周血中PDGF-BB的表達(dá)顯著升高。而在Graves病患者之間進(jìn)行比較，疾病進(jìn)展較嚴(yán)重的患者外周血PDGF-BB的表達(dá)高于癥狀較輕的患者。結(jié)果表明，PDGF-BB在外周血中表達(dá)的高低可能與Graves病發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

PDGF-BB表達(dá)的變化可能與Graves病的免疫調(diào)節(jié)紊亂相關(guān)，巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性。目前已知高表達(dá)CX3CR1的陽(yáng)性巨噬細(xì)胞能分泌ADAMTS-1、TSP-1等物質(zhì)拮抗高表達(dá)CCR2的陽(yáng)性巨噬細(xì)胞的作用[7]。兩者的平衡是維持免疫穩(wěn)定的重要因素。本試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Graves病患者外周血中CCR2陽(yáng)性巨噬細(xì)胞的表達(dá)比例顯著升高，同時(shí)疾病嚴(yán)重的患者外周血中CCR2陽(yáng)性巨噬細(xì)胞比例也高于疾病較輕的患者，表明Graves病患者體內(nèi)CCR2陽(yáng)性巨噬細(xì)胞數(shù)量發(fā)生了失調(diào)。巨噬細(xì)胞是PDGF-BB的主要分泌細(xì)胞。進(jìn)一步對(duì)PDGF-BB與陽(yáng)性巨噬細(xì)胞CCR2的表達(dá)值進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果提示兩者呈正相關(guān)。由此表明，PDGF-BB的表達(dá)改變可能與CCR2陽(yáng)性巨噬細(xì)胞比例失調(diào)相關(guān)。

本研究還進(jìn)一步檢測(cè)了HIF-1α在各個(gè)組別外周血中的表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果證實(shí)HIF-1α的表達(dá)與PDGF-BB的表達(dá)趨勢(shì)一致。以往研究表明，HIF-1α是巨噬細(xì)胞的重要刺激因子[8]。在HIF-1α刺激作用下，巨噬細(xì)胞能上調(diào)表達(dá)VEGF以及PDGF-BB。因此，巨噬細(xì)胞可能是在HIF-1α的刺激作用下，上調(diào)PDGF-BB的表達(dá)，從而參與Graves病發(fā)病的病理過(guò)程。

總之，本研究探討了Graves病患者外周血中PDGF-BB的表達(dá)趨勢(shì)以及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制，為進(jìn)一步探索PDGF-BB參與Graves病的病理過(guò)程奠定了基礎(chǔ)。

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文章編號(hào)：1002-0217(2016)04-0349-04

收稿日期：2015-09-29

作者簡(jiǎn)介：劉瑩(1989-)，女，2013級(jí)碩士研究生，(電話)15155368229，(電子信箱)sag1002@126.com；

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】【中圖號(hào)】R 581.1A

PDGF-BB expression and its implications in the peripheral blood of patients with Graves′ disease

LIU Ying,LIU Jintao,GAO Zhuanzhuan,WANG Jing,JIANG Feng

Department of Ultrasound,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

【Abstract】Objective：To determine the expression of platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) in peripheral blood of patients with Graves′ disease,and investigate the mechanism of this factor in pathogenesis of Graves′ disorder.Methods:Peripheral blood was obtained respectively from 41 patients with Graves′ disease and 41 healthy subjects.ELISA was used to determine the blood concentration of PDGF-BB and HIF-1α,and flow cytometry was performed to detect the expression of CCR2.Results:PDGF-BB and HIF-1α were expressed in the peripheral blood of the two groups,yet the concentration of PDGF-BB and HIF-1α was significantly elevated in the blood from patients with Graves′ disease(P<0.05).Flow cytometry detection further indicated that patients with Graves′ disease had higher level of CCR2-positive macrophages in peripheral blood than the healthy controls(P<0.05).Conclusion:CCR2-positive macrophages may induce the expression of PDGF-BB through HIF-1α signal,and high PDGF-BB expression may be involved in the pathogenesis of Graves′ disease.

【Key words】PDGF;Graves′ disease;macrophages;immunology

江峰，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)yjsjf@126.com,通信作者.