李　彤, 嚴(yán)雅君, 韓洪潤, 劉志薇, 吳致君, 莊　靜

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 茶葉科學(xué)研究所, 江蘇 南京 210095)

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茶樹品種‘安吉白茶’CsDREB-A4b基因的克隆及其對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)

李彤, 嚴(yán)雅君, 韓洪潤, 劉志薇, 吳致君, 莊靜①

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 茶葉科學(xué)研究所, 江蘇 南京 210095)

摘要:采用RT-PCR方法從茶樹〔Camellia sinensis (Linn.) O. Ktze.〕品種‘安吉白茶’(‘Anjibaicha’)葉片的cDNA中克隆得到1個(gè)編碼DREB轉(zhuǎn)錄因子的基因，命名為CsDREB-A4b。序列分析結(jié)果顯示，CsDREB-A4b基因包含長度為873 bp的開放閱讀框，編碼290個(gè)氨基酸，具有保守的AP2結(jié)構(gòu)域。與擬南芥〔Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.〕AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行同源進(jìn)化分析，CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子屬于DREB亞族中的A4組。多重比對(duì)結(jié)果顯示：CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子與蓖麻(Ricinus communis Linn.)等植物的DREB類轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的相似性較高。CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子為親水性蛋白，理論相對(duì)分子質(zhì)量為31 938.5，理論等電點(diǎn)為pI 5.91，總平均疏水性為-0.603，堿性、酸性、芳香族和脂肪族氨基酸的比例分別為12%、12%、7%和15%。在高溫(38 ℃)脅迫處理前期，CsDREB-A4b基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于脅迫處理前；在低溫(4 ℃)脅迫處理下，CsDREB-A4b基因的相對(duì)表達(dá)量呈顯著升高的趨勢(shì)；在鹽(200 mmol·L-1NaCl)和干旱(200 g·L-1PEG)脅迫處理下，CsDREB-A4b基因的相對(duì)表達(dá)量呈先降低后顯著升高的趨勢(shì)。表明CsDREB-A4b基因參與‘安吉白茶’非生物脅迫的響應(yīng)過程，且在不同脅迫條件下具有表達(dá)差異性。

關(guān)鍵詞：茶樹； ‘安吉白茶’; DREB轉(zhuǎn)錄因子; CsDREB-A4b基因; 非生物脅迫; 表達(dá)分析

一般情況下，當(dāng)植物在生長過程中受到逆境脅迫時(shí)，其體內(nèi)一些相關(guān)基因?qū)δ婢尺M(jìn)行響應(yīng)，使植物對(duì)逆境做出適應(yīng)性反應(yīng)?；虮磉_(dá)通常受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子在此調(diào)控過程中具有重要作用[1-2]。AP2/ERF是一類廣泛存在于植物中的重要轉(zhuǎn)錄因子，其AP2保守結(jié)構(gòu)域包含60～70個(gè)氨基酸殘基[3-4]；依據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域的差異， 可分為4個(gè)亞族(ERF、DREB、AP2和RAV)和1個(gè)單獨(dú)成員(Soloist)[5]，其中，DREB亞族主要參與植物應(yīng)對(duì)干旱、高鹽、高溫和低溫等非生物脅迫調(diào)控過程，并起重要作用[6-9]。目前，DREB類基因在玉米(ZeamaysLinn.)[10]、煙草(NicotianatabacumLinn.)[11]、大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕[12]和小麥(TriticumaestivumLinn.)[13]等植物中已有報(bào)道，在茶樹中該類基因的響應(yīng)機(jī)制尚不清楚[14-16]。

‘安吉白茶’(‘Anjibaicha’)是中國珍稀的茶樹〔Camelliasinensis(Linn.) O. Ktze.〕品種之一，屬于低溫敏感型，在芽萌發(fā)初期，當(dāng)溫度在23 ℃左右時(shí)，新梢進(jìn)入白化期[17-18]。極端的溫度和水分等非生物脅迫嚴(yán)重影響‘安吉白茶’茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來，隨著全球氣候的變化以及隨之引發(fā)的自然環(huán)境異常，茶樹經(jīng)常遭受高溫、低溫、高鹽及干旱脅迫的危害，因此必須培育茶樹抗逆新品種。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，利用分子技術(shù)輔助育種，增強(qiáng)茶樹對(duì)非生物脅迫的抗逆性具有重要意義。

作者所在課題組已有茶樹品種‘汝城毛葉茶’(‘Ruchengmaoyecha’)、‘云南十里香’(‘Yunnanshilixiang’)、‘安吉白茶’和‘槎灣三號(hào)’(‘Chawansanhao’)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并從中獲取了1個(gè)編碼DREB轉(zhuǎn)錄因子的基因CsDREB-A4b。為驗(yàn)證CsDREB-A4b基因在茶樹對(duì)非生物脅迫響應(yīng)中的作用，作者采用RT-PCR方法從‘安吉白茶’中克隆獲得CsDREB-A4b基因，對(duì)該基因進(jìn)行序列對(duì)比、蛋白理化性質(zhì)分析及系統(tǒng)進(jìn)化等生物信息分析；并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法，檢測(cè)了‘安吉白茶’中CsDREB-A4b基因在高溫、低溫、鹽和干旱脅迫條件下的表達(dá)情況，以期為明確茶樹對(duì)非生物脅迫的抗逆調(diào)控機(jī)制及茶樹抗性品種選育提供參考依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料及處理

供試材料為自然環(huán)境下種植的‘安吉白茶’2年生扦插幼苗。摘取無病害植株的幼嫩葉片，提取總RNA。分別對(duì)‘安吉白茶’健康植株進(jìn)行低溫(4 ℃)、高溫(38 ℃)、 鹽 (200 mmol·L-1NaCl)和干旱(200 g·L-1PEG)脅迫處理， 處理時(shí)間為4、 8和 12 h，以自然環(huán)境下種植的植株為對(duì)照。分別在各時(shí)間段采集不同處理的葉片，提取RNA。

大腸桿菌菌株DH5α為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院茶葉科學(xué)研究所保存；質(zhì)粒載體pMD18-T、ExTaqDNA聚合酶、SYBR PremixExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒和Prime Script RT reagent Kit試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA回收試劑盒購自杭州維特潔生化技術(shù)公司。各類引物合成和DNA測(cè)序交由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成參照Quick RNA isolation Kit試劑盒(北京華越洋生物科技有限公司)說明書進(jìn)行葉片總RNA提取，分別使用One DropTMOD-1000+超微量分光光度計(jì)(芮科科技有限公司)和質(zhì)量濃度12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和質(zhì)量。按照Prime Script RT reagent Kit試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2CsDREB-A4b基因的克隆基于本課題組測(cè)序完成的茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用AP2保守域序列進(jìn)行檢索，獲得CsDREB-A4b基因。根據(jù)CsDREB-A4b基因序列轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，正向引物ZJR80序列為5′-ATGAAGTCTCTTTCTCTCTCC-3′，反向引物ZJR82序列為5′-TCAAGCATCCCATGTCAAACTC-3′。以‘安吉白茶’葉片cDNA第1鏈為模板進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系包含2.5 mmol·L-1dNTPs Mixture 1.6 μL、 25 mmol·L-1MgCl21.2 μL、 10×ExTaqBuffer 2 μL、 5 U·μL-1ExTaqDNA聚合酶0.3 μL、cDNA 1 μL，正向引物和反向引物各1 μL，重蒸水 11.9 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s、 52 ℃退火30 s、 72 ℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。參照DNA回收試劑盒說明書將經(jīng)質(zhì)量濃度12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分離的PCR產(chǎn)物回收，然后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中。轉(zhuǎn)化后的菌液經(jīng)鑒定后測(cè)序。

1.2.3序列分析序列的保守域預(yù)測(cè)在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行，并采用BLAST進(jìn)行序列同源性比較；使用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)以及親水性和疏水性預(yù)測(cè)；使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用SMS(http:∥www.bio-soft.net/sms)和ExPASy-ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam)在線網(wǎng)站對(duì)氨基酸理化性質(zhì)、組成成分及理論等電點(diǎn)等進(jìn)行分析。采用Subcellular Localization Prediction[19]和NucPred[20]軟件完成亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2.4CsDREB-A4b基因的表達(dá)分析為了分析在高溫、低溫、鹽和干旱脅迫下‘安吉白茶’CsDREB-A4b基因的表達(dá)譜，根據(jù)SYBR PremixExTaqⅡ試劑盒說明書和iQTM5 Real-Time PCR System完成qRT-PCR。 qRT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?95 ℃ 預(yù)變性5 min； 95 ℃反應(yīng)5 s、 60 ℃反應(yīng)30 s， 40個(gè)循環(huán)； 65 ℃反應(yīng)10 s，61個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理樣本設(shè)3次重復(fù)。根據(jù)CsDREB-A4b基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)檢測(cè)引物，正向引物ZJR246-T4-28971R序列為5′-GCATCACCAACTCATCAACTT

CGTC-3′；反向引物ZJR247-T4-28971F序列為5′-AGTGCCGAGCCAAATGCGTGA-3′。采用相對(duì)定量法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCT表示，其中ΔCT=CT目標(biāo)基因-CTactin[21]；以茶樹actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，以未處理茶樹葉片為對(duì)照。

2結(jié)果和分析

2.1CsDREB-A4b基因轉(zhuǎn)錄組檢索

為獲取CsDREB-A4b基因的核苷酸序列及其在自然環(huán)境下不同茶樹品種中的表達(dá)情況，對(duì)茶樹品種‘汝城毛葉茶’、‘云南十里香’、‘槎灣三號(hào)’和‘安吉白茶’的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：CsDREB-A4b基因在‘安吉白茶’中的相對(duì)表達(dá)量最低，在‘云南十里香’和‘槎灣三號(hào)’中的相對(duì)表達(dá)量居中，在‘汝城毛葉茶’中的相對(duì)表達(dá)量最高(圖1)。據(jù)此推測(cè)‘安吉白茶’中CsDREB-A4b基因的相對(duì)表達(dá)量較低是其對(duì)非生物脅迫抗逆性較差的原因之一，因此，本研究對(duì)‘安吉白茶’的CsDREB-A4b基因進(jìn)行克隆及相關(guān)分析。

RC: ‘汝城毛葉茶’‘Ruchengmaoyecha’; YN: ‘云南十里香’‘Yunnanshilixiang’; CW: ‘槎灣三號(hào)’‘Chawansanhao’; AJ: ‘安吉白茶’‘Anjibaicha’.

圖1CsDREB-A4b基因在4個(gè)茶樹品種中的表達(dá)譜

Fig. 1Expression profile ofCsDREB-A4bgene in four cultivars ofCamelliasinensis(Linn.) O. Ktze.

2.2CsDREB-A4b基因的克隆

依據(jù)引物ZJR80和ZJR82，以‘安吉白茶’葉片cDNA為模板，擴(kuò)增得到長度約900 bp的特異性片段。對(duì)開放閱讀框(ORF)的預(yù)測(cè)及序列分析結(jié)果表明：該CsDREB-A4b基因包含1個(gè)長度為873 bp的開放閱讀框，編碼290個(gè)氨基酸(圖2)。

2.3CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化分析

利用BLAST-Conserved Domains Search對(duì)茶樹品種‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見圖3。在第110位至第170位區(qū)域間含有1個(gè)保守的AP2結(jié)構(gòu)域，說明該轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/ERF家族。

利用MEGA 5.0軟件，構(gòu)建CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果顯示：‘安吉白茶’中CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子屬于DREB亞族的A4組。

*： 終止密碼子 Stop codon.

圖2茶樹品種‘安吉白茶’CsDREB-A4b基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列

Fig. 2cDNA sequence ofCsDREB-A4bgene from cultivar ‘Anjibaicha’ ofCamelliasinensis(Linn.) O. Ktze. and

its encoded amino acid sequence

圖3　茶樹品種‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子的保守域預(yù)測(cè)Fig. 3　Prediction on conserved domain of CsDREB-A4b transcription factor from cultivar ‘Anjibaicha’ of Camellia sinensis (Linn.) O. Ktze.

圖4　茶樹品種‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4　Phylogenetic tree of CsDREB-A4b transcription factor from cultivar ‘Anjibaicha’ of Camellia sinensis (Linn.) O. Ktze. and AP2/ERF transcription factors from Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.

2.4CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列比對(duì)、理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

為了進(jìn)一步分析茶樹品種‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域，將其保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與其他植物DREB類轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)(圖5)。結(jié)果顯示：‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子與SolanumlycopersicumLinn.(XP_004241746.1)、蓖麻(RicinuscommunisLinn.，XP_002515992.1)、Prunuspersica(Linn.) Batsch(XP_007202464.1)、荷花(NelumbonuciferaGaertn.，XP_010249578.1)、可可(TheobromacacaoLinn.，XP_007012129.1)、馬鈴薯(SolanumtuberosumLinn.，XP_006359467.1)、毛果楊(PopulustrichocarpaTorr. et Gray，XP_002298236.1)、葡萄(VitisviniferaLinn.，XP_002283864.1)、NicotianatomentosiformisGoodsp.(XP_009596664.1)、甜橙〔Citrussinensis(Linn.) Osbeck，XP_006465666.1〕、蕪菁(BrassicarapaLinn.，XP_009108829.1)、芝麻(SesamumindicumLinn.，XP_011072408.1)和林生煙草(NicotianasylvestrisSpeg.，XP_009776195.1)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域一致性較高，并在N端存在YRG和WLG元件。

圖5　茶樹品種‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子和其他植物DREB類轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果Fig. 5　Result of multiple alignment on amino acid sequences of conserved domains in CsDREB-A4b transcription factor from cultivar ‘Anjibaicha’ of Camellia sinensis (Linn.) O. Ktze. and DREB transcription factors from other plants

茶樹品種‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子和上述植物DREB類轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸組成及理化性質(zhì)見表1。由表1可以看出：茶樹品種‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子和上述植物DREB類轉(zhuǎn)錄因子氨基酸數(shù)量為192～290，理論相對(duì)分子質(zhì)量為21 472.1～31 938.5，理論等電點(diǎn)約為pI 5，堿性氨基酸比例略低于酸性氨基酸比例，平均芳香族氨基酸比例為7.5%，平均脂肪族氨基酸比例為16.7%，總平均疏水性為-0.346～-0.657。

利用DNAMAN 6.0軟件對(duì)‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行親水性和疏水性分析(圖6)。結(jié)果顯示：CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子中的氨基酸大部分屬于親水性氨基酸。其中位于第95位的賴氨酸(Lys)的疏水性最弱，位于第19位的蘇氨酸(Thr)的親水性最弱。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子被定位在細(xì)胞核中。

表1茶樹品種‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子與其他植物DREB類轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的理化性質(zhì)分析

Table 1Analyses on physical and chemical properties of amino acid sequences of CsDREB-A4b transcription factor from cultivar ‘Anjibaicha’ ofCamelliasinensis(Linn.) O. Ktze. and DREB transcription factors from other plants

種類1) Species1)登錄號(hào)No.ofaccession氨基酸數(shù)量Numberofaminoacids理論相對(duì)分子質(zhì)量Theoreticalrelativemolecularmass理論等電點(diǎn)Theoreticalisoelectricpoint比例/%2) Percentage2)BAACARAL總平均疏水性Grandaverageofhydrophobicity 129031938.55.911212715-0.6032XP_002515992.124125855.64.921013618-0.3463XP_007202464.126228536.44.941012813-0.6574XP_004241746.119221472.14.991416819-0.4635XP_010249578.123726110.04.931114816-0.5616XP_007012129.126128444.54.981012817-0.5157XP_002283864.124126129.94.991113716-0.5448XP_006359467.121824482.65.061316816-0.5709XP_002298236.123325474.45.371213718-0.42610XP_009596664.119622054.75.541314918-0.53611XP_006465666.124326830.54.711216618-0.59812XP_009108829.123225856.64.751216916-0.54813XP_009776195.119922114.85.981413720-0.45914XP_011072408.121523354.15.861313714-0.487

1)1: 茶樹品種‘安吉白茶’Cultivar ‘Anjibaicha’ ofC.sinensis; 2: 蓖麻RicinuscommunisLinn.; 3:Prunuspersica(Linn.) Batsch; 4:SolanumlycopersicumLinn.; 5: 荷花NelumbonuciferaGaertn.; 6: 可可TheobromacacaoLinn.; 7: 葡萄VitisviniferaLinn.; 8: 馬鈴薯SolanumtuberosumLinn.; 9: 毛果楊PopulustrichocarpaTorr. et Gray; 10:NicotianatomentosiformisGoodsp.; 11: 甜橙Citrussinensis(Linn.) Osbeck; 12: 蕪菁BrassicarapaLinn.; 13: 林生煙草NicotianasylvestrisSpeg.; 14: 芝麻SesamumindicumLinn.

2)BA: 堿性氨基酸Basic amino acids; AC: 酸性氨基酸Acidic amino acids; AR: 芳香族氨基酸Aromatic amino acids; AL: 脂肪族氨基酸Aliphatic amino acids.

圖6　茶樹品種‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的親水性(A)和疏水性(B)分析Fig. 6　Analyses on hydrophilicity (A) and hydrophobicity (B) of amino acid sequence of CsDREB-A4b transcription factor from cultivar ‘Anjibaicha’ of Camellia sinensis (Linn.) O. Ktze.

2.5CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)茶樹品種‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示：CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，所占比例分別為27.24%、13.45%、4.14%和55.17%。

與CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子的三級(jí)結(jié)構(gòu)最為相似的轉(zhuǎn)錄因子是擬南芥AP2/ERF家族中的AtERF1轉(zhuǎn)錄因子[22]，其N端有1個(gè)α-螺旋，C端有3個(gè)β-折疊。CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子與AtERF1轉(zhuǎn)錄因子的差異位點(diǎn)有15個(gè)，其中位于α-螺旋區(qū)域的位點(diǎn)有7個(gè)，位于β-折疊區(qū)域的位點(diǎn)有8個(gè)，但是這些差異位點(diǎn)對(duì)CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子的三級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有顯著影響(圖8)。

圖7　茶樹品種‘安吉白茶’CSDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 7　Secondary structure of CsDREB-A4b transcription factor from cultivar ‘Anjibaicha’ of Camellia sinensis (Linn.) O. Ktze.

圖8　茶樹品種‘安吉白茶’CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥AtERF1轉(zhuǎn)錄因子[22]的三級(jí)結(jié)構(gòu)比較Fig. 8　Comparison on tertiary structures of CsDREB-A4b transcription factor from cultivar ‘Anjibaicha’ of Camellia sinensis(Linn.) O. Ktze. and AtERF1 transcription factor from Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.[22]

2.6CsDREB-A4b基因的表達(dá)分析

利用qRT-PCR對(duì)茶樹品種‘安吉白茶’葉片中CsDREB-A4b基因在高溫(38 ℃)、低溫(4 ℃)、鹽(200 mmol·L-1NaCl)和干旱(200 g·L-1PEG)脅迫條件下的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖9)表明：在上述4種脅迫條件下，CsDREB-A4b基因均可表達(dá)，但其相對(duì)表達(dá)量在不同脅迫處理和脅迫時(shí)間下存在差異。高溫脅迫處理組，在脅迫4和8 hCsDREB-A4b基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照。低溫脅迫處理組，CsDREB-A4b基因的相對(duì)表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長顯著升高。鹽脅迫處理組，脅迫4 hCsDREB-A4b基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照，脅迫8 h其相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照無顯著差異，脅迫12 h其相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照。干旱脅迫處理組，脅迫4 h時(shí)CsDREB-A4b基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照無顯著差異，脅迫8 h時(shí)則顯著低于對(duì)照，而在脅迫12 h時(shí)顯著高于對(duì)照。在高溫、低溫、鹽和干旱脅迫條件下，CsDREB-A4b基因的相對(duì)表達(dá)量分別在脅迫4、12、12和12 h達(dá)到最高，分別為對(duì)照的8.0、8.0、24.0和2.5倍。

CK: 對(duì)照 The control; T1: 脅迫4 h Stressing for 4 h; T2: 脅迫8 h Stressing for 8 h; T3: 脅迫12 h Stressing for 12 h.

不同的小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05) Different small letters indicate the significant difference among different treatments (P<0.05).

圖9在38 ℃高溫(A)、4 ℃低溫(B)、200 mmol·L-1NaCl(C)和200 g·L-1PEG(D)脅迫處理下

茶樹品種‘安吉白茶’葉片中CsDREB-A4b基因的相對(duì)表達(dá)量分析

Fig. 9Analysis on relative expression ofCsDREB-A4bgene in leaf of cultivar ‘Anjibaicha’ ofCamelliasinensis(Linn.) O. Ktze. in 38 ℃ high temperature (A), 4 ℃ low temperature (B), 200 mmol·L-1NaCl (C) and 200 g·L-1PEG (D) stress treatments

3討論和結(jié)論

DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)一類很重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠識(shí)別并特異性結(jié)合干旱響應(yīng)基因啟動(dòng)子DRE/CRT元件，從而提高植物的抗逆性，在植物響應(yīng)低溫、干旱和高鹽等非生物逆境脅迫的分子應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[23]。DREB/CBF亞族又被分成A1至A6共6個(gè)組，其中A3至A6組的比例高，占整個(gè)DREB/CBF亞族的75%[6,24]，但仍未確定其在植物的逆境調(diào)控過程中的具體作用。

目前，DREB-A4類轉(zhuǎn)錄因子相繼在一些物種中被分離和克隆出來，如陸地棉(GossypiumhirsutumLinn.)[25]和擬南芥[26]，并已證實(shí)其在低溫脅迫時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)。在茶樹中有關(guān)DREB類轉(zhuǎn)錄因子的研究也證實(shí)了其參與茶樹的溫度脅迫響應(yīng)過程[27]。茶樹品種‘安吉白茶’是一種低溫敏感型樹種，其有機(jī)物積累和茶葉品質(zhì)受溫度變化影響極大[28-29]。本研究從‘安吉白茶’中克隆得到CsDREB-A4b基因，且研究結(jié)果表明CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子屬于DREB亞族A4組，與多種植物DREB轉(zhuǎn)錄因子AP2結(jié)合域的氨基酸序列同源性很高，且該轉(zhuǎn)錄因子的三級(jí)結(jié)構(gòu)與擬南芥AtERF1轉(zhuǎn)錄因子的相似程度較高，雖然有15個(gè)差異位點(diǎn)，但是這些差異位點(diǎn)對(duì)CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子的三級(jí)結(jié)構(gòu)影響較小[22]。

‘安吉白茶’葉片中CsDREB-A4b基因在高溫、低溫、鹽和干旱脅迫處理下均可表達(dá)，但相對(duì)表達(dá)量存在差異。在高溫脅迫處理前期，CsDREB-A4b基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照，而在低溫脅迫處理下，隨著脅迫時(shí)間延長，其相對(duì)表達(dá)量持續(xù)上升，推測(cè)CsDREB-A4b基因在提高‘安吉白茶’耐寒性方面發(fā)揮作用。已有研究結(jié)果表明：含有順式作用元件DRE的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A能有效提高植物對(duì)低溫、干旱和高鹽的耐受性[23]。袁紅雨等[30]認(rèn)為，茶樹CsCBF1基因受低溫快速誘導(dǎo)表達(dá)，與本文中CsDREB-A4b基因表達(dá)有差異，說明不同DREB類轉(zhuǎn)錄因子的功能具有差異性和復(fù)雜性。在鹽脅迫處理下，隨著脅迫時(shí)間延長，CsDREB-A4b基因的表達(dá)量呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，可能是由于在200 mmol·L-1NaCl處理下，CsDREB-A4b基因要經(jīng)歷1個(gè)啟動(dòng)期才能被誘導(dǎo)表達(dá)[8]。CsDREB-A4b基因在干旱脅迫下的表達(dá)與在鹽脅迫下較為相似。杜洪偉等[31]認(rèn)為DREB基因受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，能增強(qiáng)其耐旱性。由于轉(zhuǎn)錄因子功能的復(fù)雜性和茶樹自身的特性，‘安吉白茶’中CsDREB-A4b轉(zhuǎn)錄因子在不同逆境中的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步多方面的分析和探討。

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(責(zé)任編輯： 張明霞)

收稿日期：2015-05-13

基金項(xiàng)目：國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410307030); 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31200520; 31570691)

作者簡介：李彤(1993—)，女，貴州貴陽人，本科，主要從事茶樹分子生物學(xué)方面的研究。 ①通信作者E-mail: zhuangjing@njau.edu.cn

中圖分類號(hào)：Q786; S571.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-7895(2016)02-0001-09

DOI:10.3969/j.issn.1674-7895.2016.02.01

Cloning ofCsDREB-A4bgene from cultivar ‘Anjibaicha’ ofCamelliasinensisand its response to abiotic stress

LI Tong, YAN Yajun, HAN Hongrun, LIU Zhiwei, WU Zhijun, ZHUANG Jing①

(Tea Research Institute, College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China),J.PlantResour. &Environ., 2016, 25(2): 1-9

Abstract:A gene encoding DREB transcription factor was cloned from cDNA in leaf of cultivar ‘Anjibaicha’ of Camellia sinensis (Linn.) O. Ktze. by RT-PCR method, which was named as CsDREB-A4b. The result of sequence analysis shows that CsDREB-A4b gene contains an open reading frame with length of 873 bp, 290 amino acids are encoded, which has a conserved AP2 domain. By homologous evolutionary analysis with AP2/ERF family transcription factors from Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh., CsDREB-A4b transcription factor belongs to A4 group in DREB subfamily. The result of multiple alignment shows that amino acid sequence of conserved domain in CsDREB-A4b transcription factor has high similarity to that in DREB transcription factors from other plants, such as Ricinus communis Linn., etc. CsDREB-A4b transcription factor is hydrophilic protein, theoretical relative molecularmassis 31 938.5, theoreticalisoelectricpointispI 5.91, grandaverageofhydrophobicityis -0.603, and in which, percentages of basic, acidic, aromatic and aliphatic amino acids are 12%, 12%, 7% and 15%, respectively. In the early stage of high temperature (38 ℃) stress treatment, relative expression of CsDREB-A4b gene is significantly higher than that before stress treatment. Under low temperature (4 ℃) stress treatment, that of CsDREB-A4b gene appears a significantly increasing trend. Under salt (200 mmol·L-1NaCl) and drought (200 g·L-1PEG) stress treatments, that of CsDREB-A4b gene appears the trend of firstly decreasing and then significantly increasing. It is indicated that CsDREB-A4b gene participates in response process of ‘Anjibaicha’ to abiotic stress and shows differences in expression under conditions of different stress treatments.

Key words:Camellia sinensis (Linn.) O. Ktze.; ‘Anjibaicha’; DREB transcription factor; CsDREB-A4b gene; abiotic stress; expression analysis