徐秀麗，殷婷婷，溫洪宇，孫怡，高霞莉

（江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇　徐州　221116）

徐州北郊魚塘水體細菌多樣性研究及致病菌分析

徐秀麗，殷婷婷，溫洪宇，孫怡，高霞莉

（江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州221116）

魚塘的健康養(yǎng)殖受到多種因素的制約，如魚的種類以及魚塘的面積大小等，同時，魚塘水體中的細菌對魚類存活更是帶來重大影響。本文對徐州北郊鯽魚魚塘水體中細菌多樣性及致病菌對鯽魚存活狀況的影響進行了研究，為補充完善我國魚塘養(yǎng)殖環(huán)境中微生物的物種資源及魚塘健康養(yǎng)殖提供了重要參考依據(jù)，旨在進一步實現(xiàn)魚塘的科學(xué)管理。水樣采集于夏季6月份，為魚病頻發(fā)季節(jié)，氣溫與水溫相對較高，魚塘中細菌數(shù)量多。研究主要是通過對鯽魚魚塘水體中細菌的總DNA進行提取，經(jīng)過PCR擴增并依據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行分子發(fā)育學(xué)研究，最后獲得水體中細菌物種的組成。它們分別為崛越氏芽孢桿菌（Bacillus horikoshii）、Aeromonas punctata、Bacillus thaonhiensis、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、弗氏志賀菌（Shigella flexneri）、印度芽孢桿菌（Bacillus indicus）、Fictibacillus phosphorivorans、Enterobacter soli、Bacillus aryabhattai。經(jīng)檢測其中Aeromonas punctata、弗氏志賀菌（Shigella flexneri）及溶血性葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）為致病菌。

多樣性；陽性菌；陰性菌；致病菌；16S rRNA；系統(tǒng)發(fā)育樹

隨著科學(xué)技術(shù)的進步，人們生活質(zhì)量逐漸提高，水產(chǎn)品的日需量呈上升趨勢，使得我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有很大的發(fā)展［1］。魚塘養(yǎng)殖是我國飼養(yǎng)食用魚的重要手段之一，在養(yǎng)殖過程中，魚塘水體中的細菌對魚類的生存帶來了很大的影響。在整個生態(tài)系統(tǒng)中，細菌占據(jù)重要地位，對魚塘環(huán)境中的物質(zhì)循環(huán)有很大影響，它不僅作為分解者，也是魚類重要的生存指標［2］，且細菌在促進水體有機物分解、營養(yǎng)鹽釋放和保持良好的水質(zhì)方面也發(fā)揮了極大的作用［3］。

近年來，很多國內(nèi)外科學(xué)家對魚塘中的細菌做出分析與研究，包括細菌的多樣性、群落結(jié)構(gòu)、對魚類生存的影響、特殊菌株細胞生活機制等。如Ahmed H.Al-Harbi等研究沙特阿拉伯某魚塘水體底泥中細菌群落隨季節(jié)變化的特點，發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)魚塘水體底泥中的細菌數(shù)量各不相同，其中夏季魚塘水體底泥中細菌的數(shù)量達到了高峰［4-5］；程瑩寅等對養(yǎng)殖草魚魚塘水體中細菌的多樣性特征進行了研究，表明魚塘水體底泥中細菌含量十分豐富且存在致病菌種，給魚塘中草魚的生存帶來威脅［6］；邵桂元等對影響魚類健康的細菌進行了研究，發(fā)現(xiàn)蛭弧菌可減少魚塘中魚類疾病的發(fā)生，降低魚類病死率［7］；楊艷等人研究了巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）對養(yǎng)殖魚塘水質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)其對魚塘水質(zhì)凈化具有明顯作用［8］。充分研究徐州北郊鯽魚魚塘水體中細菌的數(shù)量變化及致病菌對生存的影響將有助于我們了解魚塘生態(tài)系統(tǒng)中的這一重要資源，給魚類養(yǎng)殖模式的優(yōu)化及有效控制病害發(fā)展帶來重大的意義［9］。

16S rRNA基因序列檢測技術(shù)近年來應(yīng)用廣泛，如曹波等人曾利用16S rRNA基因測序技術(shù)檢測長江口細菌得到細菌群落組成［10］；朱詩應(yīng)等的研究表明16S rDNA測序技術(shù)能夠區(qū)分細菌并將其鑒定到具體種水平［11］。16S rRNA基因是核糖體RNA的一個小亞基，由16S rDNA編碼而來［12］。本研究基于16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行分子發(fā)育學(xué)分析的方法檢測出水體中9種不同的細菌，分析該魚塘中細菌的多樣性及致病菌的功能作用，為魚塘健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)，進一步實現(xiàn)魚塘的合理放養(yǎng)，科學(xué)管理。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1水樣采集試驗所選用的水體樣品于2014 年6月采集于徐州北郊鯽魚養(yǎng)殖魚塘。用采水器采樣，4℃保存。

1.1.2配制培養(yǎng)基試驗前配制好培養(yǎng)基，放置在壓力蒸汽滅菌器中，溫度設(shè)置為121℃滅菌25 min，備用。

1.1.3主要儀器PCR擴增儀、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、LX-100手掌型離心機、DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）、LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、DNA回收試劑盒、BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1對菌種進行劃線分離與純化并斜面保存采取水樣后，4℃保存。試驗時取1 mL水樣接種到滅菌后的固體培養(yǎng)基上，放置在37℃環(huán)境下培養(yǎng)3 d。對平板上的單一菌落反復(fù)劃線以達到分離目的，最終得到純菌株，接種至斜面，4℃保存。

1.2.2革蘭染色若在顯微鏡下觀察到染色結(jié)果是紫色，則可以判斷為革蘭陽性菌；若是紅色，則判斷為革蘭陰性菌。

1.2.3細菌總DNA抽提及電泳分析抽提細菌的總DNA基因組于-20℃保存?zhèn)溆?；對總DNA進行電泳，dd H2O漂洗，溴化乙啶染色最后采用BIORAD系統(tǒng)拍照。

1.2.4細菌的PCR擴增擴增時設(shè)置以27F和1492R分別作為正向引物和反向引物。正向引物為27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'（對應(yīng)于E. coli 16S rRNA基因的8-27個堿基位置）。反向引物1492R：5'-CTACGGTTACCTTGTTACGAC-3'（對應(yīng)于E.coli 16S rRNA基因的第1492—1510個堿基位置）［13］。在95℃條件下進行預(yù)變性；約5 min后變性，溫度為94℃，45 s后，降溫至55℃退火45s，72℃延伸1 min，此過程重復(fù)多次后得到的產(chǎn)物在低溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5PCR擴增產(chǎn)物電泳分析在冷卻的1%的瓊脂糖凝膠中加入3 μL擴增產(chǎn)物，放入到電泳槽中，在電壓92V，電泳時間40 min條件下進行電泳，dd H2O漂洗，溴化乙啶染色，最后采用BIO-RAD系統(tǒng)拍照。

1.2.6PCR擴增產(chǎn)物膠回收空且干凈的離心管稱重；加入從凝膠上剪切下的單一目的基因條帶，再稱重；接著向0.1 g凝膠中加入3倍體積的溶膠液即300 μL，水浴溫度為55℃，時間為10 min；將剛獲得的溶液倒進吸附柱，放至管內(nèi)離心，棄去上層液體，放至原管內(nèi)。在吸附柱中兩次分別加入700 μL、500 μL漂洗液，重復(fù)上述步驟最后洗去漂洗液；吸附柱暴露放置除掉未洗凈的溶液；最后把吸附柱放在管內(nèi)，加洗脫液，25℃靜放3 min，離心60 s；低溫保藏目的基因。

1.2.7測序測出菌種的目的基因產(chǎn)物序列。

1.2.8構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進行分子發(fā)育學(xué)分析研究。

2　結(jié)果與分析

2.1革蘭染色結(jié)果

劃線分離之后獲得純種菌株，分別編號A2、A3、A4、A5、A6、B2、B3、B4、C1，其中 A2、A4、A5、B2、B3、C1染色結(jié)果為紫色，因而可以判斷為革蘭陽性菌；A3、A6、B4染色結(jié)果為紅色，因而可以判斷為革蘭陰性菌。

2.2系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖1可以看出：革蘭陽性菌A2與芽孢桿菌屬中的模式菌株崛越氏芽孢桿菌（Bacillus horikoshii DSM 8719T） 聚為一支，登錄號為X76443，置信度為100%，兩者同源性高于98%，親緣關(guān)系相近，所以認為A2與Bacillus horikoshii屬于同一物種［14］；革蘭陽性菌A4與芽孢桿菌屬中的模式菌株（Bacillus thaonhiensis NHI-38 T）的16S rRNA基因序列同源性高于98%，其登錄號為JQ796719，置信度為100%，說明兩者親緣關(guān)系相近且屬于同一物種；革蘭陽性菌A5與葡萄球菌屬中的 模式菌 株溶血 葡萄球 菌（Staphylococcushaemolyticus ATCC 29970 T）聚為一支，登錄號為L37600，置信度為100%，兩者同源性高于98%，親緣關(guān)系相近，所以認為 A5與 Staphylococcus haemolyticus為同一物種；革蘭陽性菌B2與芽孢桿菌屬中的模式菌株印度芽孢桿菌（Bacillus indicus Sd/3T）聚為一支，登錄號為AJ583158，置信度為100%，兩者同源性高于98%，親緣關(guān)系相近，所以認為B2與Bacillus indicus屬于同一物種；革蘭陽性菌B3與模式菌株（Fictibacillus phosphorivorans Ca7T T）的16S rRNA基因序列同源性達到了98%以上，其登錄號為JX258924，置信度為100%，親緣關(guān)系相近，所以認為B3與Fictibacillus phosphorivorans為同一物種，屬于芽孢桿菌屬；革蘭陽性菌C1與芽孢桿菌屬中的模式菌株（Bacillus aryabhattai B8W22T）聚為一支，登錄號為HQ433471，置信度為100%且同源性高于98%，親緣關(guān)系相近，所以認為C1與Bacillus aryabhattai屬于同一物種。

圖1　鄰接法構(gòu)建的16S rRNA基因序列的革蘭陽性菌系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2　鄰接法構(gòu)建的16S rRNA基因序列的革蘭陰性菌系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖2可以看出：革蘭陰性菌A3與氣單胞菌屬中的模式菌株（Aeromonas punctata subsp.caviae ATCC 15468 T）的16S rRNA基因序列同源性達到了98%以上，其登錄號為X74674，置信度為99%，親緣關(guān)系相近，所以A3與Aeromonas punctata subsp.caviae屬于同一物種；革蘭陰性菌A6與模式菌株（Shigella flexneri ATCC 29903T）聚為一支，登錄號為X96963，置信度為98%且同源性高于98%，親緣關(guān)系相近，所以認為A6與Shigella flexneri屬于同一物種，中文名稱為弗氏志賀菌，屬于志賀菌屬；革蘭陰性菌B4與腸桿菌屬中的模式菌株（Enterobactersoli LF7aT）的16S rRNA基因序列同源性達到了98%以上，其登錄號為CP003026，置信度為99%，所以兩者親緣關(guān)系相近，屬于同一物種。

3　討論

魚塘中細菌數(shù)量隨著季節(jié)交替呈現(xiàn)波動性變化，選擇6月份采集水樣是由于水體中細菌數(shù)量較多，且致病菌十分活躍，夏季光照較強，氣溫與水溫相對較高，水中藻類數(shù)量增多，水體富營養(yǎng)化嚴重，導(dǎo)致水體中細菌數(shù)量大幅度增多；春季和秋季水體中細菌數(shù)量保持在一定的范圍之內(nèi)，冬季氣溫較低，水體中的細菌數(shù)量相對較少［15］。

本文所獲得的9種菌株，其中A2、A4、B2、B3、C1均屬于芽孢桿菌屬，A3屬于氣單胞菌屬，A5屬于葡萄球菌屬，A6屬于志賀菌屬，B4屬于腸桿菌屬。同時，通過檢測發(fā)現(xiàn)水體中存在大量的致病菌，如本試驗中的氣單胞菌屬（Aeromonas punctata）、弗氏志賀菌（Shigella flexneri） 和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）。

文章研究的3種致病菌對魚類均可產(chǎn)生一定的致病性。氣單胞菌屬（Aeromonas punctata）致病性很強，在淡水、海水、魚類及脊椎動物腸道最為常見，能引起鯽魚、鯉魚等魚類和家禽以及人體共同患病，故魚塘管理人員應(yīng)采取措施抑制該致病菌對魚類的危害，從而提高該魚塘中鯽魚產(chǎn)量與質(zhì)量［16］。蘇國富研究表明弗市志賀菌（Shigella flexneri）是典型的致病菌，它的有毒基因分布在魚類染色體和大質(zhì)粒上，對魚塘中如鯽魚、羅非魚等魚類生長有一定的危害，表現(xiàn)為呼吸困難，體內(nèi)供能物質(zhì)合成受阻，最終耗盡營養(yǎng)導(dǎo)致重大疾病甚至死亡［17］。溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）會使魚類皮膚受損甚至壞死，一旦作用于魚體細胞時間過長，則會使魚類死亡。

氣單胞菌屬（Aeromonas punctata）、弗氏志賀菌（Shigella flexneri）和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）這三種致病菌會破壞魚塘中原有的生態(tài)平衡，使魚類的自身機能受限、發(fā)育遲緩、免疫機制受阻，患病概率增加并且病死率上升，導(dǎo)致魚塘中魚類的生存受到極大的威脅［18］。在夏季魚類疾病高發(fā)時段，為提高產(chǎn)量，健康養(yǎng)殖，管理人員應(yīng)提前做好對致病菌的防范措施，向魚塘中投放能抑制氣單胞菌屬（Aeromonas punctata）、弗氏志賀菌（Shigella flexneri） 和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）生長的抑制劑或投放如益生菌等促進魚類生長改善水體環(huán)境的菌液并定期給魚塘換水。另外，投放益生菌菌液不宜過多，在一定的范圍內(nèi)，投放菌液濃度越高效果越好，超過了某一特定范圍效果則會降低［19］。

在魚塘水體中發(fā)現(xiàn)的9種菌里有5種均屬于芽孢桿菌，而芽孢桿菌對于魚塘水體的影響已有許多研究，如楊鶯鶯等［20］研究發(fā)現(xiàn)魚塘水體細菌群落特征受芽孢桿菌的影響，其通過改善代謝能力進而使細菌對有機廢物的分解能力大幅提升，達到改善水質(zhì)的目的；董愛華等［21］發(fā)現(xiàn)在羅非魚魚塘中添加芽孢桿菌，水體透明度明顯增加，魚塘中NH3、NH4+、H2S等含量明顯下降，同時有害藻繁殖速度明顯降低，該研究表明芽孢桿菌屬能改良水體水質(zhì)，預(yù)防魚類疾病?？梢娦熘荼苯荐a魚魚塘水體中的A2 （Bacillus horikoshii）、A4（Bacillus thaonhiensis）、B2 （Bacillus indicus）、B3（Fictibacillus phosphorivorans）、C1（Bacillus aryabhattai）等芽孢桿菌對于改善魚塘水質(zhì)，降低魚類發(fā)病率有著重要作用，因此在魚塘養(yǎng)殖過程中管理人員還可以通過適量投放芽孢桿菌作為益生菌的方法，更大程度上凈化魚塘水質(zhì)，提高魚類產(chǎn)量。

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Study on bacterial diversity and analysis of pathogenic bacteria in fish pond water in the north of Xuzhou

Xu Xiuli，Yin Tingting，Wen Hongyu，Sun Yi，Gao Xiali
（School of Life Science Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116，China）

Healthy breeding of fish ponds restricted by many factors，such as the types of fish and fish ponds area size，etc.，at the same time，the bacteria in fish pond water for fish survival but also bring significant impact. Study on the effect of bacterial diversity and pathogen on fish survival status of the fish pond water in the north of Xuzhou can not only improve our microbial species resources of aquiculture environment，but also provide an important reference for the healthy breeding of the fish ponds.Water samples were collected in the summer of June，the temperature and the temperature is relatively high.The research is mainly through 16S rRNA gene sequencing of the fish pond water bacteria in the north of Xuzhou，and the 16S rRNA gene sequence analysis of phylogenetic tree construction，finally get the composition of bacterial species in water.After testing，we found that there were nine kinds of bacteria in fish pond water，they were Bacillus horikoshii、Aeromonas punctata、Bacillus thaonhiensis、Staphylococcus haemolyticus、Shigella flexneri、Bacillus indicus、Fictibacillus phosphorivorans、Enterobacter soli、Bacillus aryabhattai.The Aeromonas punctata、Staphylococcus haemolyticus and Shigella flexneri were pathogenic bacteria.

diversity；Gram-negative bacteria；Gram-positive bacteria；pathogenic bacteria；16S rRNA；Phylogenetic tree

S949

A

1004-2091（2016）01-0019-05

10.3969/j.issn.1004-2091.2016.01.004

江蘇省大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目（201410320026）

徐秀麗（1993-），女，理學(xué)學(xué)士，研究方向：微生物學(xué).E-mail：821311076@qq.com

溫洪宇（1973-），男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究.E-mail:wenhy2007@126.com

2015-06-17）