耿艷華 王昌興 石仕元 董黎強(qiáng) 謝文君 趙毅

補(bǔ)腎活血方對(duì)早期激素性股骨頭壞死血液粘滯性基因表達(dá)影響的研究

耿艷華 王昌興 石仕元 董黎強(qiáng) 謝文君 趙毅

目的 探討補(bǔ)腎活血方對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠病變?cè)缙谘赫硿曰虮磉_(dá)及病理生理改變的影響。方法 成年健康SD大鼠30只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組，中藥組以及對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組及中藥組先予腹腔注射內(nèi)毒素20g/kg，間隔24h，分2次注射，然后肌注甲強(qiáng)龍40mg/kg，連續(xù)注射3次，間隔24h。造模后中藥組予補(bǔ)腎活血方灌胃，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均用等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，分別在造模后第3周處死大鼠，取大鼠左側(cè)股骨頭洗凈、做矢狀對(duì)半分開(kāi)，一半行石蠟包埋、制備組織病理HE切片，另一半行基因芯片制作、分析及熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果 組織病理學(xué)檢測(cè)顯示骨髓腔未見(jiàn)擴(kuò)張，營(yíng)養(yǎng)血管充盈情況良好，血管密度輕度增加。骨小梁間基質(zhì)未見(jiàn)萎縮、退變，關(guān)節(jié)軟骨厚度、細(xì)胞成熟度、生發(fā)層次序及生長(zhǎng)板上中藥組均好于實(shí)驗(yàn)組，并接近于正常對(duì)照組組織。基因芯片結(jié)果顯示，中藥組與實(shí)驗(yàn)組比較，ASPG，CRISPLD2和PLA2G2A的表達(dá)均明顯增高（倍數(shù)變化＞2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，中藥組三種基因ASPG，CRISPLD2和PLA2G2A表達(dá)均顯著高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 激素性股骨頭壞死早期相關(guān)血液粘滯性基因表達(dá)均出現(xiàn)明顯下調(diào)，提示信號(hào)傳導(dǎo)分子基因ASPG，CRISPLD2和PLA2G2A是早期的SNFH發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起作用的關(guān)鍵基因。補(bǔ)腎活血方能有效恢復(fù)股骨頭血液粘滯性相關(guān)基因表達(dá)的改變，促進(jìn)骨代謝動(dòng)態(tài)平衡恢復(fù)，使早期股骨頭病損得以及時(shí)修復(fù)。

激素性股骨頭壞死 血粘度 SD大鼠 補(bǔ)腎活血 基因表達(dá)

激素性股骨頭是壞死是現(xiàn)今臨床骨科常見(jiàn)疾病，目前發(fā)病率已超過(guò)外傷所致的股骨頭壞死。目前該病的治療方法較多，而中藥治療也是其熱點(diǎn)之一。補(bǔ)腎活血中藥可以促進(jìn)血供改善和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，抑制骨髓源性破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)用誘導(dǎo)激素性股骨頭壞死模型研究病變初期進(jìn)行中藥干預(yù)情況下，大鼠股骨頭組織病理學(xué)以及血粘度相關(guān)基因表達(dá)變化，進(jìn)一步探討補(bǔ)腎活血方對(duì)激素性股骨頭壞死早期血粘度基因表達(dá)調(diào)節(jié)變化和病理生理改變，為早期治療股骨頭壞死、指導(dǎo)臨床診治以及中醫(yī)新藥的研發(fā)提供相關(guān)理論依據(jù)。

1　 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模 健康SD大鼠，體重（200±10）g，30只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將上述大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組，中藥組，對(duì)照組各10只，所有大鼠在同一條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組予內(nèi)毒素20g/kg注射，間隔24h，分2次注射，再間隔24h，注射甲強(qiáng)龍40mg/kg，連續(xù)注射3次，間隔24h。中藥組前5d處理同實(shí)驗(yàn)組，第6天開(kāi)始予補(bǔ)腎活血湯灌胃。對(duì)照組，連續(xù)5d等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，正常飼養(yǎng)。所有大鼠均于第3周處死，使用脊髓脫臼法處死大鼠，沿腹部向下剪開(kāi)，顯露恥骨聯(lián)合，沿矢狀位剪斷恥骨聯(lián)合和髖關(guān)節(jié)剪開(kāi)關(guān)節(jié)囊，將股骨頭完整分離出來(lái)，并去除其周?chē)能浗M織，用咬骨鉗沿股骨頸以及股骨粗隆部離斷，取出大鼠左側(cè)股骨頭洗凈、做矢狀對(duì)半分開(kāi)，一半以10%中性福爾馬林固定，EDTA-Na （pH7.4） 脫鈣，石蠟包埋，制備組織病理HE切片，對(duì)另一半以DEPC漂洗，冷凍存儲(chǔ)，液氮罐轉(zhuǎn)入-80℃冰箱以制備基因芯片分析及熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 （1）中藥補(bǔ)腎活血方制備：采用三七6g、當(dāng)歸15g、血竭9g、川芎10g、生地30g、赤芍15g、枳殼10g、川斷10g、骨碎補(bǔ)20g、補(bǔ)骨脂12g、枸杞子6g、地鱉蟲(chóng)9g組成補(bǔ)腎活血方。（2）制備方法：稱取30倍量的處方加入適量的水浸泡，然后加入10倍量的水放入密閉式高壓自動(dòng)煎藥機(jī)中煎煮，先后3次，將所得藥液混合，趁熱過(guò)濾，2次冷藏、離心后，再濃縮、減壓干燥、碾細(xì)，篩得補(bǔ)腎活血湯細(xì)粉。實(shí)驗(yàn)灌胃時(shí)將補(bǔ)腎活血湯細(xì)粉溶化至含生藥2g/ml備用。（3）動(dòng)物用藥的換算：根據(jù)公式：A動(dòng)物劑量=B動(dòng)物劑量（mg/kg）×A動(dòng)物的體表面積比值/B動(dòng)物的體表面積比值及趙金東［1］報(bào)道的激素性股骨頭壞死造模法，大腸桿菌內(nèi)毒素大鼠的劑量約為20g/kg；甲基強(qiáng)的松龍大鼠用量約為40mg/kg。

1.3 組織病理學(xué)觀察 股骨頭放入10%中性甲醛固定，EDTA-Na脫鈣，乙醇脫水，石蠟包埋切片，切片厚4μm，HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.4 基因芯片分析 基因芯片制作及檢測(cè)委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。

1.5 熒光定量PCR檢測(cè) 采用比較Ct值法進(jìn)行相對(duì)定量的數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　 結(jié)果

2.1 股骨頭HE染色觀察 實(shí)驗(yàn)組：骨髓腔萎縮，營(yíng)養(yǎng)血管充盈減少，官腔血管密度減低，髓腔血管上移至關(guān)節(jié)面下。骨小梁間基質(zhì)增寬、退變，關(guān)節(jié)軟骨厚度變薄、細(xì)胞成熟度欠佳且不均衡、細(xì)胞數(shù)減少，軟骨生發(fā)層萎縮伴有次序紊亂，生長(zhǎng)板消失，營(yíng)養(yǎng)血管供血下降（見(jiàn)圖1、2）。中藥組：大鼠股骨頭骨髓腔未見(jiàn)擴(kuò)張，營(yíng)養(yǎng)血管充盈情況良好，血管密度輕度增加，供血良好。骨小梁間基質(zhì)未見(jiàn)萎縮、退變，關(guān)節(jié)軟骨厚度接近正常，軟骨細(xì)胞成熟，生發(fā)層萎縮不顯著，生發(fā)層次序存在及生長(zhǎng)板有殘留（見(jiàn)圖3、4）。對(duì)照組：大鼠股骨頭骨髓腔未見(jiàn)擴(kuò)張，營(yíng)養(yǎng)血管充盈情況良好，血管密度，供血好。骨小梁間基質(zhì)未見(jiàn)萎縮、退變，大鼠股骨頭關(guān)節(jié)表面軟骨厚度正常，軟骨細(xì)胞成熟，生發(fā)層正常，生發(fā)層萎縮不顯著，生發(fā)層次序好及生長(zhǎng)板明顯（見(jiàn)圖5、6）。

圖1 實(shí)驗(yàn)組骨髓腔縮?。℉E×10）

圖 2 實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育不良（HE×10）

圖3 中藥組骨髓腔未縮?。℉E×10）

圖4 中藥組關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育（HE×10）

圖5 對(duì)照組骨髓腔擴(kuò)張（HE×10）

圖6 對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨成熟（HE×10）

2.2 基因芯片檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組ASPG、CRISPLD2和PLA2G2A表達(dá)明顯下降 （ fold change＞2），中藥組較實(shí)驗(yàn)組則顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 熒光定量PCR檢測(cè) 中藥組ASPG、 CRISPLD2和PLA2G2A與對(duì)照組大致相同，但比實(shí)驗(yàn)組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明補(bǔ)腎活血方對(duì)于激素性股骨頭壞死的治療切實(shí)有效，且效果較為明顯。見(jiàn)表1。

表1 3組ASPG、CRISPLD2和PLA2G2A基因在股骨頭組織中的相對(duì)定量表達(dá)值

3　 討論

3.1 補(bǔ)腎活血方對(duì)骨壞死的治療作用 補(bǔ)腎活血方在治療骨質(zhì)疏松癥的療效已得到大量實(shí)驗(yàn)研究及臨床療效的證實(shí)［2］。近年相關(guān)研究較多，證實(shí)補(bǔ)腎活血中藥具有促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化功能。胡黎平等［3］在補(bǔ)腎方劑對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響的實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為補(bǔ)腎方劑可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化及礦化。也有學(xué)者［4］在補(bǔ)腎方劑對(duì)大鼠成骨樣細(xì)胞增殖及相關(guān)酶類(lèi)的影響的研究中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎方劑在一定的濃度范圍均能增加成骨樣細(xì)胞增殖，認(rèn)為補(bǔ)腎方劑可活躍和增進(jìn)信號(hào)傳導(dǎo)，可能是其促進(jìn)細(xì)胞增殖的一種機(jī)制。且補(bǔ)腎活血中藥可以提高骨髓中多種活血、成骨有關(guān)因子的表達(dá)［5］，還可以抑制骨髓源性破骨細(xì)胞的生成［6］。

3.2 早期股骨頭壞死血液粘調(diào)性相關(guān)基因異常表達(dá)的意義 研究認(rèn)為ASPG參與凝血過(guò)程的改變。早期的SINFH模型凝血功能下降，推測(cè)其低表達(dá)直接或間接參與影響凝血過(guò)程。有研究顯示肝臟60-kDa溶血磷脂酶包含了一個(gè)天冬酰胺酶樣區(qū)和錨蛋白重復(fù)序列。當(dāng)轉(zhuǎn)染大鼠cDNA編碼的溶血磷脂到HEK293細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)不僅溶血磷脂的活性被表達(dá)，天冬酰胺酶和血小板激活因子乙酰水解酶的活性也被表達(dá)［7］。不同的錨蛋白重復(fù)序列涉及組織的分化和細(xì)胞周期的控制，這個(gè)錨蛋白重復(fù)序列一個(gè)主要功能是蛋白質(zhì)相互作用［8］，重要的是近來(lái)也顯示包含一個(gè)非鈣依賴的磷脂酶A［9］。錨蛋白重復(fù)在非鈣依賴的磷脂酶A2顯示通過(guò)低聚復(fù)合物的形成參與影響酶活性。這種酶可能與其他可以調(diào)節(jié)酶的活性蛋白質(zhì)以復(fù)合物的形式存在。識(shí)別和描述這樣的結(jié)合蛋白在認(rèn)識(shí)60-kDa溶血磷脂酶的調(diào)節(jié)和生理機(jī)能上提供了有用的信息。這些氨基酸在60-kDa溶血磷脂酶的催化活上性起著關(guān)鍵作用，且Thr116作為親核物質(zhì)涉及?；钢虚g物的形成，有報(bào)道稱Thr116Asn是早老素presenilin-1 的一個(gè)突變體或替代物［10］，可見(jiàn)在早期SINFH大鼠模型中天冬酰胺酶和磷脂酶A2互相作用，共同影響著凝血活性、組織分化和細(xì)胞周期的變化，并于這個(gè)過(guò)程中出現(xiàn)了與致病基因有關(guān)的早老性改變，而本資料中，補(bǔ)腎活血方劑在SINFH大鼠病變?cè)缙诘膽?yīng)用可能改變了這個(gè)過(guò)程。

PLA2是一種能催化磷脂甘油分子上二位酰基的水解酶，亦是花生四烯酸（AA）、前列腺素及血小板活化因子（PAF）等生物活性物質(zhì)生成的限速酶，所產(chǎn)生的脂質(zhì)介質(zhì)在炎癥和組織損傷時(shí)活化膜通道、信息傳遞、改變血流動(dòng)力學(xué)及病理生理過(guò)程，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外代謝中起關(guān)鍵性作用［11］。有研究表明多重磷脂酶A2 參與骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的炎癥過(guò)程，炎癥因子IL-1β，TNF 和 PAF 誘導(dǎo)PLA2的釋放，在骨關(guān)節(jié)炎時(shí)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞sPLA2-IID 釋放是個(gè)新發(fā)現(xiàn)［12］。本資料顯示病變?cè)缙诔齈LA2低表達(dá)導(dǎo)致血液粘滯性下降外，還出現(xiàn)因此而致的關(guān)節(jié)軟骨損傷，說(shuō)明這些因素的確參與了動(dòng)物早期模型的建立過(guò)程，但在中藥實(shí)驗(yàn)組中被活血補(bǔ)腎湯劑明顯逆轉(zhuǎn)。

研究表明CRISPLD2的表達(dá)并不能改變疾病嚴(yán)重程度，CRISPLD2 水平可能潛在反映宿主對(duì)感染的反應(yīng)，調(diào)節(jié)CRISPLD2表達(dá)失敗表明感染已經(jīng)進(jìn)入嚴(yán)重階段并失控。傳統(tǒng)膿毒癥治療的一個(gè)缺點(diǎn)是一旦檢測(cè)到內(nèi)在休克的指征，免疫事件的雪崩式觸發(fā)就以全幀速率進(jìn)行，其再也不能停止，并被逆轉(zhuǎn)［13］。這有力地證明疾病一旦觸及CRISPLD2的臨界閾限，免疫抑制將進(jìn)入一個(gè)不可逆過(guò)程。中藥治療組中差異性表達(dá)基因的連續(xù)上調(diào)提示在其出現(xiàn)差異性表達(dá)前就給予中藥制劑對(duì)疾病的治療和恢復(fù)是至關(guān)重要的，證明最有效的治療方式是阻止差異性基因塌方式的啟動(dòng)。激素性股骨頭壞死早期相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)分子基因表達(dá)均出現(xiàn)明顯下調(diào)，提示ASPG，CRISPLD2和PLA2G2A在早期的SINFH血液粘調(diào)度改變過(guò)程中起關(guān)鍵作用。補(bǔ)腎活血方能有效恢復(fù)股骨頭血粘度相關(guān)基因表達(dá)的改變，促進(jìn)骨代謝動(dòng)態(tài)平衡恢復(fù)，促進(jìn)早期股骨頭病損的修復(fù)。

1 趙金東， 呂松芩， 薛震，等. 激素型股骨頭壞死動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià). 中國(guó)骨傷骨病， 2007， 6（4）： 220～225.

2 陳希， 梁祖建， 邵敏. 補(bǔ)腎健脾活血方對(duì)骨質(zhì)疏松癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)的調(diào)控作用. 新中醫(yī)， 2008， 40（3）： 60～62.

3 胡黎平， 涂平生， 謝富康. 補(bǔ)腎方劑對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響. 中國(guó)藥物與臨床， 2007， 7（5）： 329～331.

4 曲耀華， 劉彬， 厲永強(qiáng). 補(bǔ)腎方劑對(duì)大鼠成骨樣細(xì)胞增殖及相關(guān)酶類(lèi)的影響. 山東中醫(yī)雜志， 2003， 22（7）： 424～425.

5 劉金文， 黃永明， 許少健. 中藥骨碎補(bǔ)對(duì)大鼠骨髓破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響. 中醫(yī)研究， 2007， 18（7）： 5～7.

6 曾天舒， 陳璐璐， 夏文芳等. 補(bǔ)腎壯骨中藥對(duì)大鼠去卵巢后早期白細(xì)胞介素6介導(dǎo)的骨髓源性破骨細(xì)胞形成的影響 .中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005， 25（2）： 143～146.

7 Sugimoto H， Odani S， Yamashita S. Cloning and expression of cDNA encoding rat liver 60-kDa lysophospholipase containing an asparaginase-like region and ankyrin repeat. J Biol Chem. 1998， 273（20）：12536～12342.

8 Lux SE， John KM， Bennett V. Analysis of cDNA for human erythrocyte ankyrin indicates a repeated structure with homology to tissuedifferentiation and cell-cycle control proteins. Nature， 1990， 344（6261）：36～42.

9 Tang J， Kriz RW， Wolfman N， et al. A novel cytosolic calciumindependent phospholipase A2 contains eight ankyrin motifs. J Biol Chem， 1997， 272（13）： 8567～8575.

10 La Bella V， Liguori M， Cittadella R， Settipani N， Piccoli T， Manna I，Quattrone A， Piccoli F. A novel mutation （Thr116Ile） in the presenilin 1 gene in a patient with early-onset Alzheimer's disease. Eur J Neurol，2004 ， 11（8）： 521～524.

11 Murakami M， Kudo I. Phospholipase A2. J Biochem， 2002， 131（3）：285～292.

12 Leistad L， Feuerherm AJ， Faxvaag A， et al. Multiple phospholipase A2 enzymes participate in the inflammatory process in osteoarthritic cartilage. Scand J Rheumatol， 2011，40（4）： 308～316.

13 Wang ZQ， Xing WM， Fan HH， et al. The novel lipopolysaccharide -binding protein CRISPLD2 is a critical serum protein to regulate endotoxin function. J Immunol， 2009， 183： 6646～6656.

Objective To investigate the treatment of early Steroid-induced necrosis of femoral head （SINFH） by Bushen Huoxue decoction，and research the effect on the regulation changes of Gene expression of blood viscosity and correlation with pathomorphology. Methods 30 adult healthy SD rats were involved in this research and randomly divided into experimental group，Chinese medicine group and the control group. The experimental group and Chinese medicine group were intraperitoneally injected endotoxin 20g/kg per day for twice，and then intramuscular injected methyl prednisolone 40ml/kg per day for thrice. After building，Chinese medicine group was given Bushen Huoxue decoction 2ml per day by fi lling the stomach，while the experimental group and control group with the equivalent 0.9% normal saline. All the rats were sacrifi ced in 3 weeks after building. The left femoral heads were stripped neatly and dissected immediately from the coronal plane，and then half of were preparing for the gene chip analysis and fl uorescence quantitative PCR detection. The other half were prepared for paraffi n embedding and sectioned and stained with H& E. Results Histopathological test showed the marrow cavity wasn't expansion but with slight density increasing of blood vessel，blood supply was good，the situation no matter from articular cartilage thickness of femoral head，maturity of cartilage cells，germinal layer showed in Chinese medicine group were better than that of the experimental group，and close to the normal control group. According to the results of Gene chips，compared to the experimental group，the Chinese medicine group had a signifi cant high expression of ASPG，CRISPLD2 and PLA2G2A （fold change＞2）. The results of fl uorescence quantitative PCR detection show that the Chinese medicine group of three genes ASPG，CRISPLD2 and PLA2G2Aexpression were signifi cantly in the experimental group（P＜0.01）. Conclusion Signaling molecule gene expression are signifi cantly lower in the initial stage of steroid-induced avascular aseptic necrosis of femoral head，prompting that ASPG，CRISPLD2 and PLA2G2A were the key genes in the process of SNFH's occurrence and development. The Bushen Huoxue decoction can effectively restore the femoral head signaling molecule gene related with blood viscosity，promote bone metabolic dynamic balance recovery，repair the early femoral head necrosis.

Steroid-induced femoral head necrosis blood viscosity gene chip Bushen Huoxue Decoction SD rats

浙江省科技廳項(xiàng)目（N20120675、2012C33035）

310003 杭州市紅會(huì)醫(yī)院（耿艷華 石仕元 謝文君趙毅）310005 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院（王昌興 董黎強(qiáng)）