趙煥強(qiáng)， 鄒玉涵， 金　姝， 舒　文， 湯　榮， 劉慶中

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tst和pvl基因陽性金黃色葡萄球菌流行情況及分子特征

趙煥強(qiáng)1， 鄒玉涵2， 金姝2， 舒文1， 湯榮1， 劉慶中1

摘要：目的 了解中毒性休克綜合征毒素-1的tst基因和殺白細(xì)胞素的pvl基因陽性金黃色葡萄球菌（金葡菌）流行情況及其附屬基因調(diào)節(jié)子（agr）和葡萄球菌盒式染色體（SCCmec）型別。方法 收集上海市及浙江省共7所醫(yī)院的916株金葡菌，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測tst、pvl、mecA和mecC基因，并對tst或pvl基因陽性菌株作agr及SCCmec （針對甲氧西林耐藥金葡菌，MRSA）遺傳學(xué)分型。結(jié)果 916株金葡菌中tst陽性208株，陽性率22.7 %；pvl陽性35株，陽性率3.8 %；mecA陽性665株（MRSA），未檢測到mecC基因。在665株MRSA中，tst陽性198株（29.8 %），agr和SCCmec分型均以2/Ⅱ型為主，分別占97.0 %和94.4 %；pvl陽性14株（2.1 %），agr分型以1型（85.7 %）為主，SCCmec分型以Ⅲ型（42.9 %）和Ⅳa型（28.6 %）為主。在251株甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）中，tst陽性10株（4.0 %）；pvl陽性21株（8.4 %）。tst陽性率在MRSA菌株中較MSSA中高，而pvl檢出率則在MSSA菌株中較高，且浙江地區(qū)MRSA中 pvl的陽性率高于上海菌株，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 tst基因在MRSA菌株中陽性率較MSSA高；pvl陽性率相對較低，但因其與某些嚴(yán)重的金葡菌感染相關(guān)，臨床應(yīng)予以關(guān)注。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌； tst基因； pvl基因； SCCmec分型； agr分型

金黃色葡萄球菌（金葡菌）是引起醫(yī)院和社區(qū)感染的常見病原菌。尤其是甲氧西林耐藥金葡菌（MRSA），其耐藥譜廣，致病性強(qiáng)，并可引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，嚴(yán)重威脅人類健康。金葡菌引起的各種臨床感染與該菌表達(dá)的多種毒力因子密切相關(guān)，攜帶中毒性休克綜合征毒素-1（toxic shock syndrome toxin-1， TSST-1）或（和）殺白細(xì)胞素（panton-valentine leukocidin， PVL）基因的菌株毒力更強(qiáng)，與患者感染后疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［1］。

本研究對上海市及浙江省共7所綜合性醫(yī)院分離的916株金葡菌進(jìn)行pvl和tst基因檢測，以了解這2種基因在臨床分離的金葡菌中分布狀況，同時對2種基因陽性菌株作agr和SCCmec分型，為豐富臨床感染菌株的分子流行病學(xué)資料提供數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株

收集上海市和浙江省7所醫(yī)院分離自尿液痰液、分泌物、血液、膿液、引流液和咽拭子等標(biāo)本的916株非重復(fù)金葡菌：2013年1月—2014 年12月上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院113株2010年2月—2014年3月上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院514株、2013年1月—2014年12月上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院82株、2014年8—10月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院23株、2013年2月—2014年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院71株、2014年1—12月浙江蕭山醫(yī)院30株、2014年1—10月浙江麗水市中心醫(yī)院83株。所有金葡菌的分離及鑒定嚴(yán)格按照臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.2儀器與試劑

VITEK-2系列全自動微生物鑒定儀為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠電泳儀及圖像處理系統(tǒng)為上海天能科技有限公司產(chǎn)品；PCR緩沖液、三磷酸脫氧核糖核苷（dNTPs）和Taq酶為MBI公司產(chǎn)品；蛋白酶K為Merch公司產(chǎn)品；溶葡酶購自上海生工生物工程有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物的合成及擴(kuò)增產(chǎn)物測序由上海生工生物工程有限公司完成。PCR所用擴(kuò)增tst、pvl、mecA、mecC基因，SCCmec及agr分型的引物序列［2-7］，見表1。

表1　PCR擴(kuò)增所用引物Table 1 Primers used in PCR amplifcation

1.3DNA模板的制備

將金葡菌轉(zhuǎn)種于血平皿，35 ℃孵育16～18 h。挑取2～3個菌落，混懸于100 μL pH 8.0的TE緩沖液中，加溶葡酶 （1 mg/mL） 5 μL，37 ℃水浴35 min，100 ℃金屬浴20 min，12 000×g離心5 min，取上清液-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4mecA、mecC、tst 和pvl 基基因檢測

PCR擴(kuò)增mecA、mecC、tst及pvl基因，擴(kuò)增體系25 μL，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性30 s，53 ℃ （mecA和mecC） 或55 ℃（pvl和tst） 退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳 （5 V/cm） 20 min，凝膠成像系統(tǒng)分析PCR產(chǎn)物。隨機(jī)挑選每個基因的一PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)BLAST程序比對分析證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物基因的正確性。1.5分型

對tst或（和）pvl基因陽性菌株進(jìn)行agr分型，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。對tst或（和）pvl基因陽性MRSA菌株參照文獻(xiàn)，多重PCR進(jìn)行SCCmec分型［6］。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

agr 和SCCmec采用SAS 9.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，行卡方檢驗(yàn)和確切概率法檢驗(yàn)，比較率的差別，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MRSA菌株確定

916株金葡菌中665株檢出mecA基因，被確認(rèn)為MRSA；其余251株未檢出mecA及mecC基因，為MSSA。

2.2tst 和pvl 基因在金葡菌中的分布

tst 和pvl 基因在金葡菌中的分布情況，見表 2 和圖1。tst 陽性菌株數(shù)大于pvl 陽性菌株數(shù)；tst基因多檢出于MRSA，與MSSA 中的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 29.8 ％ 對 4.0 ％，P＜0.05），而pvl基因在MSSA 中的檢出率明顯高于MRSA（ 8.4 ％對 2.1 ％，P＜0.05）。tst 基因陽性菌株主要分布于重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）、燒傷科、骨科、呼吸內(nèi)科及腫瘤科；pvl陽性菌株主要分布于ICU、皮膚科、 燒傷科及骨科。發(fā)現(xiàn)2株MRSA同時攜帶tst和pvl基因，分別來自ICU患者的痰液和骨科患者的創(chuàng)面分泌物。

表2　tst和pvl基因在金葡菌中的檢出情況Table 2 Detection of tst and pvl genes in S.aureus

圖1　tst、pvl及mecA基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Figure 1 Electrophoretic analysis of the PCR products of tst，pvl and mecA genes in S. aureus

滬浙兩地MRSA的 tst陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （29.9 % 對 27.8 %，P＞0.05），pvl陽性率有顯著差異 （1.1 % 對 19.4 %，P＜0.05）；兩地MSSA的 tst及pvl陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各醫(yī)院之間tst及pvl陽性率差別較大，其中上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院MRSA tst基因陽性率最高（37.4 %），上海地區(qū)其他4所醫(yī)院MRSA tst總陽性率為7.1 %（11/156）。分型

2.3agr 及SCCmec

198株tst陽性的MRSA中，192株為agr 2型（97.0 %），3株為agr 1型，3株未能分型，未發(fā)現(xiàn)agr 3及 4型；SCCmec分型以SCCmec Ⅱ型為主，占94.4 % （ 187/198），另有3株為SCCmecⅢ型，1株為SCCmec Ⅳa型，7株未能分型。10株tst陽性MSSA中，agr 1和2型各5株。

14株pvl陽性MRSA 中，agr分型以agr 1型為主 （85.7 %，12/14），另各有1株為agr 2和3型；SCCmec分型以Ⅲ型和Ⅳa型為主，分別占42.9 % （6/14）和28.6 % （4/14），另有1株Ⅱ型，3株未能分型。21株pvl陽性MSSA的 agr分型則以agr 1和3型為主，分別占66.7 % （14/21）和23.8 % （5/21），另有2株為agr 4型。部分菌株SCCmec分型，見圖2。

圖2　SCCmec分型電泳結(jié)果Figure 2 Results of gel electrophoresis for SCCmec typing

3　討論

金葡菌尤其是MRSA危害人類健康的關(guān)鍵在于它日益增強(qiáng)的耐藥性及具有分泌各種毒素的潛能［8］。TSST-1是金葡菌產(chǎn)生的一種毒素蛋白 （相對分子質(zhì)量219 000），由位于致病島2 （SaPI2）上的tst基因編碼，是中毒性休克綜合征的主要致病因子［8］，中毒性休克綜合征起病急驟、進(jìn)展迅速，常伴有多器官功能損害，具有較高病死率，因而受到世界各國學(xué)者的關(guān)注。PVL是一種鉆孔毒素，其兩種組分LukS-PV和LukF-PV能協(xié)同破壞宿主多形核細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞膜，促使靶細(xì)胞釋放多種炎性介質(zhì)，引發(fā)血管擴(kuò)張、炎性細(xì)胞浸潤、組織壞死等一系列炎性反應(yīng)，最終使細(xì)胞壞死或凋亡。有研究表明，相對于pvl陰性金葡菌，pvl陽性菌株引起的侵襲性感染患者的住院時間更長［9］，且感染pvl陽性菌株的患者趨于年輕化［10］。

據(jù)世界不同國家和地區(qū)的報(bào)道，tst陽性菌株在臨床分離的MRSA中占10 %～90 %：日本［11］、伊朗［12］、荷蘭［13］等報(bào)道，臨床分離率分別為75 %、11.6 %、17 %；國內(nèi)王鳳玲等［1］報(bào)道為12.2 %，張傳領(lǐng)等［14］對460株金葡菌行tst檢測，總檢出率22.8 %，其中在MRSA中檢出率為29.4 %，MSSA中為18.6 %。以上數(shù)據(jù)表明，金葡菌tst基因的攜帶情況可能與地域差異有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，tst的總檢出率（22.7 %）及在MRSA中的檢出率（29.8 %）與張傳領(lǐng)等［14］的報(bào)道基本一致，且MRSA的tst基因檢出率高于MSSA （29.8 % 對 4.0 %），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；滬浙兩地MRSA tst基因陽性率無顯著差異 （29.9 % 對 27.8 %，P＞0.05）。從醫(yī)院分布來看，上海某醫(yī)院MRSA tst基因陽性率最高（37.4 %），可能與該院分離菌株的標(biāo)本類型 （主要為痰液）及科室來源分布（有較大部分菌株分布在介入科、腫瘤科、呼吸內(nèi)科、中醫(yī)科等老年人較多的科室）較單一導(dǎo)致流行克隆株較單一有關(guān)。若去除該醫(yī)院的473 株MRSA，分析上海地區(qū)MRSA tst基因陽性率，則降低為7.1 %，可能此數(shù)據(jù)更具有代表性。

同樣，pvl基因的陽性率也存在地域差異：國外有報(bào)道MSSA 中pvl陽性率為30 %［10］，MRSA中為20 %［15］；CUPANE等［9］對拉脫維亞一所兒童醫(yī)院分離的金葡菌研究發(fā)現(xiàn)，pvl基因陽性率甚至達(dá)75 %，其中MSSA占60.7 %。近年國內(nèi)有關(guān)報(bào)道MRSA中 pvl陽性率在0～40%［1，16-19］；關(guān)于MSSA中pvl陽性率的報(bào)道較少，王鳳玲等［1］報(bào)道為2l.2 % ，鄒自英等［17］為11.4 %。本研究結(jié)果顯示，分離自滬浙7所醫(yī)院的臨床MRSA中pvl陽性率為2.1 %，MSSA中為8.4 %，均處于較低水平，且檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2.1 % 對 8.4 %，P＜0.05）；滬浙兩地MRSA pvl基因陽性率明顯不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （1.1 %對 19.4 %，P＜0.05）。浙江地區(qū)兩所醫(yī)院MRSA pvl總陽性率 （19.4 %）與張傳領(lǐng)等［20］報(bào)道的浙江地區(qū)MRSA pvl分布情況（20.8 %）基本一致。在35株pvl陽性菌株中60 %為MSSA，由于MSSA的耐藥譜相對較窄，所引起的感染往往被臨床忽視，而產(chǎn)PVL菌株的致病力強(qiáng)，可能會給患者造成不良后果。

有報(bào)道稱，tst 陽性 MRSA可能與agr 3型有關(guān)［21］， SCCmec分型以 Ⅱ和Ⅲ型居多［14］。而本研究tst陽性MRSA以agr2/SCCmecⅡ型為主，分別占97.0 %和94.4 %；tst陽性MSSA中agr 2型也占了較大比例（50 %）。國外有文獻(xiàn)報(bào)道，社區(qū)獲得性MRSA易攜帶pvl基因，SCCmec分型常為Ⅳ型或Ⅴ型［22］，而國內(nèi)張傳領(lǐng)等［20］檢出的104株pvl陽性菌株以 SCCmecⅢ型和Ⅱ型為主；姚丹等［23］報(bào)道的8株pvl陽性社區(qū)獲得性MRSA 中，6株為SCCmec Ⅲ型 （75 %），2株為SCCmecⅡ型 （25 %）。本研究結(jié)果與上述報(bào)道有所不同：pvl陽性MRSA 以SCCmec Ⅲ型和Ⅳa型為主，分別占42.9 %和28.6 %。此外，14株pvl陽性MRSA中，85.7% 為agr 1型；21株pvl陽性MSSA以agr 1和3型為主，分別占66.7 %和23.8 %。ZHAO等［24］報(bào)道顯示，pvl陽性金葡菌的agr分型較分散，未發(fā)現(xiàn)與某種agr型別有特定聯(lián)系。本研究中pvl陽性菌株與agr 1或3型是否關(guān)聯(lián)還有待更大量的菌株數(shù)據(jù)證實(shí)。本研究同時發(fā)現(xiàn)2株MRSA同時攜帶tst和pvl基因，1株為agr 2/SCCmec Ⅱ型，另1株為agr 1/SCCmecⅣa型。有報(bào)道稱攜帶基因pvl 和tst的MRSA除對萬古霉素敏感外，對其他抗菌劑均耐藥［1］，應(yīng)引起臨床注意。

致謝：感謝上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院湯瑾、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院張正銀、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院韓立中、浙江省麗水市中心醫(yī)院任建敏、浙江蕭山醫(yī)院張傳領(lǐng)提供菌株。

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2. 上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院。

中圖分類號：R378.11

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-7708（2016）03-0353-06

DOI：10.16718/j.1009-7708.2016.03.018

收稿日期：2015-06-16 修回日期：2015-08-17

基金項(xiàng)目：上海市自然科學(xué)基金（12ZR1425000）；國家自然科學(xué)基金（81371872）。

作者單位：1. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海201620；

作者簡介：趙煥強(qiáng)（1990—），男，碩士研究生，主要從事病原菌致病機(jī)制和耐藥機(jī)制研究。

通信作者：劉慶中，E-mail：jiaodamedicine@foxmail.com。

Prevalence and molecular profle of the Staphylococcus aureus strains harboring tst and/or pvl genes

ZHAO Huanqiang， ZOU Yuhan， JIN Shu， SHU Wen， TANG Rong， LIU Qingzhong. （Department of Laboratory Medicine， Shanghai First People's Hospital， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 201620， China）

Abstract:Objective To investigate the prevalence， accessory gene regulator （agr） and staphylococcal cassette chromosome mec （SCCmec， only for methicillin resistant S. aureus， MRSA） types of the S. aureus strains carrying toxic shock syndrome toxin-1 （tst） and/or panton-valentine leukocidin （pvl） genes. Methods Nine hundred and sixteen isolates of S. aureus were collected from seven hospitals in Shanghai and Zhejiang Province and subjected to detection of tst， pvl， mecA and mecC genes by polymerase chain reaction （PCR）. The agr and SCCmec （only for MRSA） types were determined in the tst or pvl gene positive isolates. Results Of the 916 isolates， 208 carried tst gene （22.7%）， 35 harbored pvl gene （3.8%）， and 665 were mecA positive （MRSA）. No isolate was mecC positive. Out of the 665 MRSA isolates， 198 hosted the tst gene （29.8%）. The most common agr and SCCmec types were agr 2 （97.0%） and SCCmec II （94.4%）， respectively. For the pvl gene， only 14 isolates were positive （2.1%）. The agr 1 （85.7%），SCCmec III （42.9%） and SCCmec IVa （28.6%） were the most common agr type and SCCmec type. In the 251 methicillin-sensitive S. aureus （MSSA） isolates， 10 carried tst gene （4.0%） and 21 carried pvl gene （8.4%）. The prevalence of tst gene in MRSA was higher than that in MSSA， while the prevalence of pvl gene was just the opposite. However， the prevalence of pvl gene in MRSA isolates from Zhejiang Province was higher than that in the MRSA isolates from Shanghai （P＜0.05）. Conclusions The prevalence of tst gene in MRSA is signifcantly higher than that in MSSA. The prevalence of pvl gene is low in the S. aureus isolates studied. However， clinicians should pay close attention to these strains due to the implication of PVL toxin in somesevere S. aureus infections.

Key words:Staphylococcus aureus； tst gene； pvl gene； SCCmec typing； agr typing