李　偉（岳陽市二人民醫(yī)院藥劑科　岳陽　414000）

HPLC-熒光檢測法測定人血大黃酸的藥代動力學(xué)和相對生物利用度

李偉（岳陽市二人民醫(yī)院藥劑科岳陽414000）

目的：建立健康志愿者血漿中大黃酸的HPLC-熒光檢測法，并研究大黃酸的藥代動力學(xué)和人體相對生物利用度。方法：血漿樣品用鹽酸沉淀后離心，乙酸乙酯萃取上清液，以水（含1%醋酸）-甲醇-乙腈（60∶15∶25，v/v）為流動相，在Kromasil C18柱（250mm× 4.6mm，5μm）上分離，流速1.0mL·min-1。20名健康志愿者以隨機雙交叉實驗方法，單劑量口服大黃酸膠囊受試制劑和參比制劑100mg，進行藥代動力學(xué)分析和生物等效性判定。結(jié)果：大黃酸在0.05～5.0μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為A=2.991c+ 0.0011，r=0.9999。定量下限為0.05μg·mL-1。單劑量口服受試制劑和參比制劑的Tmax分別為（4.03±0.7）h和（4.07±0.6）h；Cmax分別為（16.2±3.1）μg·mL-1和（15.8±2.9）μg·mL-1；t1/2分別為（5.25±1.15）h和（5.36±1.19）h；MRT0-t分別為（7.21±0.78）h和（7.13±0.81）h；AUC0-t分別為（162.6±36.1）μg·mL-1和（157.8±38.7）μg·mL-1；AUC0-∞分別為（164.9±38.5）μg·mL-1和（159.4±39.2）μg·mL-1。結(jié)論：采用梯形法計算AUC0-t，單劑量口服大黃酸膠囊后，體內(nèi)相對生物利用度為（105.6±13.1）%。經(jīng)方差分析和雙單側(cè)t檢驗表明在人體內(nèi)兩種制劑具有生物等效性。

大黃酸膠囊 藥代動力學(xué) 生物利用度

大黃酸（Rhein）廣泛分布于蓼科植物大黃、何首烏、虎杖中，是大黃游離蒽醌衍生物，具有廣泛的藥理活性，因其能有效防治II型糖尿病腎病，引起學(xué)者廣泛關(guān)注［1］。研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸具有減輕腎小球硬化、腎臟肥大，改善胰島素敏感性、降低血脂水平的作用［2］?；诿黠@的藥理作用，大黃酸在人體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究具有重要意義。本實驗參考國內(nèi)外相關(guān)研究，對20名志愿者口服大黃酸參比制劑和受試制劑后的藥代動力學(xué)進行了研究，評價其生物利用度，為該藥的臨床實驗提供參考。

1儀器與試藥

1.1儀器：日本島津高效液相色譜儀（SPD-M20A檢測器，LC-20AT型泵），CTO-10A柱溫箱，RF-10AXL熒光檢測器（日本島津）；高速離心機、SPD1010離心濃縮裝置（美國Thermo）；80-2離心沉淀器（盛威實驗儀器廠）；mini-Q Gradient AIO超純水器（Millipore公司）；KQ-50B型超聲波清洗器（上海昨非實驗室設(shè)備有限公司）。

1.2藥品與試劑：受試制劑：大黃酸膠囊（50mg·粒-1；批號：20120415；南京軍區(qū)南京總醫(yī)院）；參比試劑：大黃酸片劑（50mg·粒-1；批號：20111109；中國藥科大學(xué)）；大黃酸標(biāo)準(zhǔn)對照品（中國藥品生物制品檢定所）；1，8二羥基蒽醌（中國藥品生物制品檢定所）；甲醇（色譜純，阿爾法試劑公司）；乙腈（色譜純，Merck公司）；醋酸、鹽酸、乙酸乙酯均為分析純；水為雙蒸水；空白血漿由兗礦集團有限公司總醫(yī)院提供。

2溶液的配制

2.1大黃酸對照品溶液：精密稱取大黃酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，置100mL容量瓶中，加入甲醇搖勻，配制成100mg·L-1的儲備液，4℃冰箱保存。使用時，用甲醇稀釋至所需濃度。

2.2內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取1，8二羥基蒽醌10.0mg，置100mL容量瓶中，用甲醇溶解搖勻，配制成100mg·L-1的儲備液，4℃冰箱保存。儲備液用甲醇稀釋，配制成50.0μg·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液備用。

3給藥方案與樣品采集

試驗經(jīng)兗礦集團有限公司總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，選擇20名健康男性志愿受試者，年齡22～27歲，體重55～75kg，在實驗前于兗礦集團有限公司總醫(yī)院接受全面體檢，體檢合格后簽署知情同意書并納入實驗。

20名受試者隨機分為兩組，每組10人，采用雙周期隨機交叉試驗設(shè)計。試驗前禁食10h，早晨空腹口服大黃酸膠囊或大黃酸片劑 100mg，溫開水送服，于服藥前（0h）和服藥后0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0，12.0，24.0h由肘靜脈抽血5mL，離心分取血漿，-20℃冰箱保存。

4色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：水（含1%醋酸）-甲醇-乙腈（60∶15∶25）；流速：1.0mL·min-1；激發(fā)波長：440nm；發(fā)射波長：520nm；柱溫：35℃；進樣量：15μL。

5血漿樣品處理

取血漿樣品0.5mL，加入內(nèi)標(biāo)1，8二羥基蒽醌（50mg·L-1）50μL渦旋混勻，加入30μL鹽酸（2mol·L-1），渦旋5min，加入1mL乙酸乙酯萃取，渦旋10min，離心10min（8000r·min-1），取乙酸乙酯相N2流吹干后，加入50μL甲醇溶解，進樣15μL。

6專屬性

采用內(nèi)標(biāo)法進行測定，大黃酸與血漿中雜質(zhì)完全分離，內(nèi)源性物質(zhì)基本不干擾測定，本實驗條件下測得的色譜圖見圖1。大黃酸的保留時間8.62min，內(nèi)標(biāo)在11.78min，兩者完全分離，峰形良好，空白血漿中雜質(zhì)峰不干擾測定，本方法專屬性較高。

7標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

精密吸取空白血漿0.5mL，加入對照品儲備液，渦旋振蕩5min，用空白血漿稀釋成含大黃酸0.05，0.10，0.20，0.50，1.0，2.0，5.0μg·mL-1的血漿樣品，按照“5”中血漿樣品處理操作并測定，記錄色譜圖，以大黃酸峰面積（A）與血藥濃度（C）進行線性回歸。得線性回歸方程：A=2.991c+0.0011 r=0.9999

大黃酸在0.05～5.0μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。定量下限為0.05μg·mL-1。

8準(zhǔn)確度與精密度

去空白血漿0.5mL，按照“7”的方法配制10.0，100.0，500.0μg·L-1的質(zhì)量控制樣品，每一濃度進行5樣本分析，同一天內(nèi)測定5次，連續(xù)測定3d，記錄大黃酸峰面積，按回歸方程計算濃度，求得準(zhǔn)確度與日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表1。

表1方法的準(zhǔn)確度與精密度（n=5）

9方法的提取回收率

配制濃度為10.0，100.0，500.0μg·L-1的對照品血漿，按“7”項操作，測定峰面積A1；另外配制10.0，100.0，500.0μg·L-1的對照品溶液，進樣測定峰面積A2。每一濃度進行5樣本分析，以A1與A2之比計算提取回收率。內(nèi)標(biāo)物1，8二羥基蒽醌（1000.0μg· L-1）提取回收率實驗方法相同（表2）。

表2提取回收率（n=5）

10方法穩(wěn)定性

用空白血漿配制10.0，100.0，500.0μg·mL-1的對照品血漿，分別置于室溫放置12h、-20℃冷凍-解循環(huán)2次、-20℃冰箱保存20d，藥物穩(wěn)定性良好（表3）。

表3樣品穩(wěn)定性考察（n=3）

11 口服大黃酸藥-時曲線

兩組受試者服用受試制劑100mg后平均血藥濃度/時間曲線（圖2）。

12藥代動力學(xué)參數(shù)

20名男性健康志愿者單劑量交叉口服大黃酸膠囊受試制劑和參比制劑。經(jīng)DAS（Drug And Statistics，version 2.0）程序處理，采用非房室模型計算藥代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表4。

13單劑量口服大黃酸膠囊的相對生物利用度

兩組受試者交叉服用兩種制劑的平均生物利用度為（105.6±13.1）%，方差分析結(jié)果表明受試制劑和參比制劑的Cmax和AUC0-24之間沒有顯著差異（P＞0.05），90%置信區(qū)間受試試劑在參比試劑99.6%～112.4%之間，證明兩種制劑具有生物等效性。

14討論

14.1 20名健康志愿者服用大黃酸膠囊100mg后，根據(jù)平均血藥濃度曲線，藥代動力學(xué)參數(shù)與文獻報道基本一致［3］。由實驗結(jié)果可知，大黃酸膠囊口服給藥3～4h達到最大血藥濃度。方差分析顯示，大黃酸參比制劑和受試制劑Cmax、AUC0-t值和AUC0-∞值存在明顯個體差異，臨床用藥時需考慮個體化用藥。實驗過程，無不良反應(yīng)發(fā)生。

14.2專屬性實驗發(fā)現(xiàn)，大黃酸在光照、酸、堿、熱條件下相對穩(wěn)定。對大黃酸膠囊的色譜峰進行PDA檢測，主峰純度較好，未發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)峰。

14.3生物樣品中大黃酸的檢測常用HPLC-UV法、放射性標(biāo)記法、HPLC-MS法和固相萃取法等，HPLC-UV法檢測過程易被血漿樣品雜質(zhì)干擾，靈敏度不高，誤差較大；放射性標(biāo)記法需要價格昂貴的特殊設(shè)備，對儀器要求高，難以推廣；大黃酸臨床樣品濃度高，質(zhì)譜檢測殘留較大，HPLC-MS法難以定量測定人體內(nèi)的大黃酸；固相萃取法成本高，操作煩瑣，不利于進行大批量新藥研究。本文建立了對人血漿（0.5mL）中大黃酸濃度的HPLCFLD方法，該方法靈敏度高，雜質(zhì)干擾少。大黃酸對治療糖尿病和腎病具有一定效果，該檢測方法符合生物樣品檢測要求，為大黃酸的臨床研究提供了穩(wěn)定可靠且操作方便的檢測手段。

［1］張錦雯，王廣基，孫建國，等.HPLC-熒光檢測法測定大鼠血漿中大黃酸的濃度及其藥代動力學(xué)［J］.中國天然藥物，2005，3（4）：238.

［2］劉志紅，鄭敬民，吳義超，等.糖尿病腎病小鼠腎臟基因表達譜及大黃酸對其影響［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2002，11：201.

［3］萬萍，孫建國，郝剛，等.大黃酸的HPLC-熒光檢測及其在人體藥代動力學(xué)中的應(yīng)用［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報，2013，44（1）：73.

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