鄧雙炳　石　巖　韓　琳　涂　濤*（.深圳萬和制藥有限公司　深圳　58057；.中國(guó)食品藥品檢定研究院　北京　00050；.北京博愛旺康醫(yī)藥科技有限公司　北京　0076）

HPLC法測(cè)定富馬酸二甲酯中的有關(guān)物質(zhì)

鄧雙炳1石巖2韓琳3涂濤3*（1.深圳萬和制藥有限公司深圳518057；2.中國(guó)食品藥品檢定研究院北京100050；3.北京博愛旺康醫(yī)藥科技有限公司北京100176）

目的：建立HPLC法測(cè)定富馬酸二甲酯中的有關(guān)物質(zhì)。方法：采用C18色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。結(jié)果：富馬酸二甲酯、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B在0.2～2.0μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的平均回收率分別為98.3%和96.7%，RSD分別為2.3%和2.7%。結(jié)論：本方法的專屬性、準(zhǔn)確度、靈敏度等符合要求，可用于測(cè)定富馬酸二甲酯中的有關(guān)物質(zhì)。

富馬酸二甲酯 有關(guān)物質(zhì) 高效液相色譜 測(cè)定

2013年3月，美國(guó)Biogen公司把富馬酸二甲酯（1）開發(fā)成治療多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）新藥（商品名：Tecfidera）獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，隨后獲得歐洲藥物管理局（EMA）的批準(zhǔn)，目前在國(guó)內(nèi)還沒有獲得批準(zhǔn)。分析合成工藝路線，它可能存在的有關(guān)物質(zhì)主要有富馬酸即為雜質(zhì)A（2）、富馬酸單甲酯即為雜質(zhì)B（3），馬來酸即為雜質(zhì)C（4）、馬來酸二甲酯即為雜質(zhì)D（5）。本研究建立HPLC法用于測(cè)定1中的有關(guān)物質(zhì)，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，專屬性好、靈敏度高、準(zhǔn)確度好。

1儀器與試藥

2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）。1工作對(duì)照品（自制，含量99.7%，批號(hào)DMF-20140501）；2對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量99.4%，批號(hào)111541-201102）；3工作對(duì)照品（自制，含量97.2%，批號(hào)DMF-B-20140601）；4對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量99.7%，批號(hào)190015-201302）；5工作對(duì)照品（自制，含量98.8%，批號(hào)DMF-D-20140601）。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，水為純化水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件：色譜柱為博納艾杰爾的ASB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；流速為1mL/min；進(jìn)樣量10μL。

表1梯度洗脫程序

2.2溶液的配制：供試品溶液：取1原料藥適量，精密稱定，加甲醇適量，超聲使溶解，用流動(dòng)相稀釋制成1mg·mL-1的溶液。對(duì)照溶液：取1工作對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇適量，超聲使溶解，用流動(dòng)相稀釋制成1μg·mL-1的溶液。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液：取1、2、3、4、5對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成1的濃度約為1mg·mL-1，2、3、4、5的濃度均約為0.02mg·mL-1的混合溶液。

2.3方法學(xué)研究

2.3.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取“2.2”項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，各峰的分離度均不低于1.5（圖1）。

2.3.2專屬性

（1）已知雜質(zhì)的分離度試驗(yàn)：同系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。

（2）溶劑干擾試驗(yàn)：精密量取甲醇10μL注入液相色譜儀，結(jié)果無干擾。

（3）粗品：取1粗品10mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示僅存在2和3。

（4）降解試驗(yàn)：取1原料藥10mg，5份，置10mL量瓶中，分別進(jìn)行高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、光照的破壞試驗(yàn)，用甲醇稀釋至刻度，搖勻后分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明各破壞條件下的降解產(chǎn)物主要為2、3，其他降解雜質(zhì)均與1、2、3、4、5分離良好。

綜上，方法的專屬性良好；根據(jù)粗品和降解試驗(yàn)結(jié)果，僅對(duì)2、3按《中國(guó)藥典》［1］要求進(jìn)行定量的系統(tǒng)方法學(xué)研究，而對(duì)4、5僅進(jìn)行限度方法學(xué)研究（檢測(cè)限、專屬性、耐用性）。

2.3.3檢測(cè)限與定量限：精密稱取1、2、3、4、5對(duì)照品適量，用甲醇分別制成10μg·mL-1的對(duì)照品貯備液；分別用甲醇逐級(jí)稀釋，當(dāng)信噪比約為10時(shí)計(jì)算為定量限，當(dāng)信噪比約為3時(shí)計(jì)算為檢測(cè)限。結(jié)果顯示最低定量限分別為53.5、34.7、144.5、150.5、45.5ng·mL-1，最低檢測(cè)限分別為16.2、10.5、43.8、45.6、13.8ng·mL-1。

2.3.4線性與范圍：精密量取“2.3.3”項(xiàng)下的1、2、3對(duì)照品貯備液，用甲醇稀釋成系列濃度（0.2、0.5、0.8、1.0、1.5和2.0μg·mL-1）的溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，以樣品濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。1：A=161473.200C+11.7363，r=0.9998；2：A=16997.402C+35.0756，r=0.9992；3：A=57669.9220C－1.7478，r=0.9999。1、2、3在0.2～2.0μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法計(jì)算2、3的校正因子，分別為0.95、2.8。

2.3.5精密度

（1）進(jìn)樣精密度：取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照溶液10μL，進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積的RSD為1.5%。進(jìn)樣精密度良好。

（2）重復(fù)性：取1原料藥10mg，置10mL量瓶中，精密量取“2.3.3”項(xiàng)下的2、3對(duì)照品貯備液1mL，同法配制6份供試品溶液；按“2.2”項(xiàng)下配制對(duì)照溶液；分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算2、3含量的RSD分別為1.8%、2.5%。方法的重復(fù)性良好。

（3）中間精密度：與重復(fù)性試驗(yàn)于不同日期、不同人員、不同儀器，同法測(cè)得6個(gè)結(jié)果，與重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果合并計(jì)算RSD為2.0%、2.8%。方法的中間精密度良好。

2.3.6準(zhǔn)確度：取1原料藥10mg，9份，分別置10mL量瓶中，每3份為一組，每組分別精密加入“2.3.3”項(xiàng)下的2對(duì)照品貯備液0.5、1.0、1.5mL，精密加入3對(duì)照品貯備液0.2、0.4、0.6mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得2和3的平均回收率（n=9）分別為98.3%和96.7%，RSD分別為2.3%和2.7%。方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3.7耐用性

（1）溶液穩(wěn)定性：取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液分別于0、2、4、8、16、24h依法測(cè)定，結(jié)果主峰面積RSD為0.52%，各雜質(zhì)峰面積RSD均不大于10%，表明溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

（2）色譜參數(shù)：在流速（±0.2mL/min）、波長(zhǎng)（±2nm）、柱溫（± 5℃）、流動(dòng)相初始比例（±1%）、色譜柱（不同批號(hào)）略有改變的條件下，分別取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液、供試品溶液（加入各雜質(zhì)貯備液使含量約為0.1%）、對(duì)照溶液進(jìn)樣測(cè)定；在各條件下的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖最小分離度均不小于1.5；各條件下的各雜質(zhì)含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD均不大于10%。方法的耐用性良好。

2.4樣品測(cè)定：取三批樣品（批號(hào)140801、140802、140803）分別按“2.2”項(xiàng)下配制供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，另取對(duì)照溶液、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液同時(shí)測(cè)定，結(jié)果三批樣品中均未檢出2、4、5，檢出3的含量分別為0.05%、0.08%、0.06%。

3討論

波長(zhǎng)的選擇：將1、2、3、4、5對(duì)照品貯備液分別進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明在210nm波長(zhǎng)處均有較大吸收，并參考FDA的審批報(bào)告披露信息［2］，選擇210nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

溶劑的選擇：1為酯類遇水容易水解，故溶劑采用乙腈、甲醇，但2、4用乙腈溶解后峰型分叉或拖尾，故最終選擇甲醇為溶劑。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)，中華人民共和國(guó)藥典［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅩⅨA.

［2］FDA.Chemistry Review（s）［EB/OL］.［2014-06-15］.

Determination of Related Compound in Dimethyl Fumarate by HPLC

Deng Shuangbing1Shi Yan2Han Lin3Tu Tao3*（1.Shenzhen WanHe Pharmaceutical Co.，Ltd，Guangdong 518057，China；2.National Insitutes for Food and Drug Control，Beijing 100500，China；3.Beijing Bio-welcome Medical Technology CO.，Limited，Beijing100176，China）

Objective：The HPLC method was improved for the determination of the related compounds in dimethylfumarate.Method：A C18column was used；Used acetonitrile as mobile phase A，0.1%phosphoric acid as mobile phase B，and gradient eluted.The detection wavelength was 210nm.Results：The calibration curves for dimethyl fumarate and its related compounds A and B were linear in the range of 0.2～3μg·mL-1.The average recoveries of related compounds A and B were 98.3%（RSD=2.3%）and 96.7%（RSD=2.7%）.Conclusion：The specificity，accuracy，sensitivity，etc.meet the requirements for the determination of dimethyl fumarate related compound.

Dimethyl fumarate Related compound HPLC Determination

R927

A

1672-8351（2016）08-0006-02