張海濤　呂　穎　齊向群　李旻輝（.赤峰市藥品檢驗所　赤峰　024005；2.包頭醫(yī)學院　包頭　04040）

高效液相色譜法測定蒙藥制劑浩森布如-13中胡椒堿的含量

張海濤1呂穎1齊向群1李旻輝2*（1.赤峰市藥品檢驗所赤峰024005；2.包頭醫(yī)學院包頭014040）

目的：建立高效液相色譜法測定蒙藥制劑浩森布如-13中胡椒堿的含量。方法：采用DiamonsiL C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；以甲醇-水（77∶23）為流動相；流速1.0mL·min-1；檢測波長343nm；柱溫為30℃。結果：胡椒堿在4～40μg·mL-1（r=0.9999）范圍內(nèi)線性關系良好；平均回收率為98.19%（n=9），RSD為0.86%。結論：本方法簡便準確、穩(wěn)定可靠，可用于蒙藥制劑浩森布如-13的胡椒堿含量測定。

蒙藥制劑 高效液相色譜法 浩森布如-13胡椒堿 含量測定

蒙藥制劑浩森布如-13散劑，主要由石榴、肉桂、肉豆蔻、蓽茇、白胡椒、白巨勝、光明鹽等十三味藥組成，具有助消化止泄的功效，蒙醫(yī)主要用于治療胃巴達干病、寒性瀉等。其中蓽茇、白胡椒為臣藥，主要含有胡椒堿（piperine）、丁香烯（caryophylene）、胡椒酰胺（pipercide）等化學成分［1］。胡椒堿作為主要活性成分之一，化學結構屬于桂皮酰胺類，不僅具有抗?jié)儯?］、抗氧化［3］、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤［4］的作用，而且在眾多研究中，作為生物利用度增強劑［5］的應用越來越引起人們的重視。本研究采用高效液相色譜法測定浩森布如-13中胡椒堿的含量，對有效控制和評價產(chǎn)品質(zhì)量，具有重要的應用價值。

1儀器與試藥

美國沃特世（Waters）高效液相色譜儀（Waters2695泵，Waters2487紫外檢測器，Empower色譜工作站），島津UV-2600型紫外-可見分光光度計，瑞士Precisa型十萬分之一電子天平，昆山舒美KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機。

胡椒堿對照品（批號：0775-200203，供含量測定用），由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，水為高純水，其他試劑為分析純；浩森布如-13散劑（2.5g/袋，一次1袋，一日1次），阿拉善盟蒙醫(yī)醫(yī)院自制制劑。

2方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1對照品溶液的制備：精密稱取胡椒堿對照品約10mg，置50mL棕色量瓶中，加無水乙醇溶解、定容、搖勻，制成約200μg·mL-1的胡椒堿對照品儲備液。精密吸取胡椒堿對照品儲備液2.5mL，置50mL棕色量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2供試品溶液的制備：取浩森布如-13樣品約0.2g，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加入無水乙醇40mL，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30min，放置至室溫后，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.3陰性樣品溶液的制備：按處方比例制備不含蓽茇、白胡椒的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備操作，即得。

2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：色譜柱：DiamonsiL C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（77∶23）；流速：1.0mL· min-1；檢測波長：343nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。理論板數(shù)按胡椒堿峰計算不低于5000。分別精密吸取胡椒堿對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL，在上述色譜條件下進樣測定，色譜圖見圖1。

2.3方法學考察

2.3.1線性關系考察：精密吸取胡椒堿對照品儲備液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，分別置25mL棕色量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別取上述溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄胡椒堿色譜峰面積。以胡椒堿峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X），進行線性回歸，得線性方程為Y=7.376×104X-2.336×103，r＝0.9999（n=9）。結果表明胡椒堿進樣濃度在4～40μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.3.2精密度試驗：精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液10μL，按“2.2”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算胡椒堿峰面積的RSD（n=6）為0.40%，表明儀器精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗：精密吸取“2.1.2”項下同一供試品溶液10μL，分別于0，2，4，8，12，18，24h進樣測定，測得胡椒堿峰面積的RSD（n=7）為0.56%。結果表明，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4重復性試驗：稱取同一樣品6份，每份約0.2g，精密稱定，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定。結果胡椒堿含量的RSD為0.40%，表明重復性良好。

2.3.5加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的同一樣品9份，每份約0.08g，精密稱定，分別置50mL棕色量瓶中，分別加入胡椒堿對照品儲備液0.5，1.0，1.5mL，各3份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣10μL，結果見表1。

表1胡椒堿加樣回收試驗

2.4樣品測定：按上述建立好的方法對浩森布如-13進行含量測定，結果見表2。代表性樣品色譜圖見圖1（B）。

表2浩森布如-13樣品測定結果（X=X均±S，n=3）

3討論

本實驗通過對流動相、檢測波長、樣品超聲提取時間等條件的篩選，建立了浩森布如-13中胡椒堿含量的測定方法，比較了流動相甲醇-水［6］不同比例（60∶40；70∶30；75∶25；77∶23；80∶20；90∶10）等度洗脫時色譜峰的分離效果，結果甲醇-水的比例為77∶23時，所得色譜圖基線平直，各組分之間可以得到較好分離，峰形良好，保留時間適宜；對胡椒堿對照品溶液在200～700nm波長范圍內(nèi)掃描，胡椒堿在343nm波長處有最大吸收，故選擇343nm為檢測波長；分別考察了樣品超聲處理20min、30min和40min的提取量，結果表明超聲處理20min時提取不完全，30min與40min的提取量無明顯變化，故選擇30min作為超聲處理時間。

根據(jù)胡椒堿的光穩(wěn)定性研究，避光條件下更有利于胡椒堿的穩(wěn)定和保存［7］，故在實驗操作中使用棕色量瓶，以避免其由于分解而影響結果準確性。

本實驗建立的HPLC測定蒙藥制劑浩森布如-13中胡椒堿含量的方法操作簡單，靈敏度高，重現(xiàn)性好，結果準確，適用于浩森布如-13蒙藥制劑的質(zhì)量控制。

［1］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草［M］.蒙藥卷，上海：上?？茖W技術出版社，2004：274-275.

［2］Morikawa T，Matsuda H，Yamaguchi I，et al.New amides and gastroprotective constituents from the fruit of Piper chaba［J］.Planta Med，2004，70：152-159.

［3］Price S E，Harris S A D，Deborah J，et al.Piperine，an active ingredientofblack pepperattenuatesacetaminopheninduced hepatotoxicity in mice［J］.Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2010，3（12）：971-976.

［4］Sunila E S，Kuttan.G.Immunomodulatory and antitumor activity of Piper longum Linn and piperine［J］.Journal of Ethnopharmacology，2004，90（2-3）：339-346.

［5］Kasibhatta R，Naidu M U R.Influence of piperine on the pharmacokinetics of nevirapine under fasting conditions：A randomised，crossover，placebo-controlled study［J］.Drugs R&D，2007，8（6）：383-391.

［6］國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：219.

［7］郭墨亭，夏學進，黃雪松.胡椒堿的光異構化研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（3）：52-55.

HPLC Determination of Piperine in Mongolian Medicine Preparation Hao Sen Bu Ru-13

Zhang Haitao1Lu Ying1Qi Xiangqun1Li Minhui2*（1.Chifeng Institute for Drug Control，Chifeng 024000，Inner Mongolia，China；2. Baotou Medical College，Baotou，Inner Mongolia 014060，China）

Objective：To establish a method for the determination of piperine in mongolian medicine preparation Haosenburu-13. Methods：A DiamonsiL-C18（250mm×4.6mm，5μm）column was used with the mobile phase being chromatographic methanol-water（77∶23），flow rate being 1.0mL·min-1，detecting wavelength being 343nm，the column temperature being 30℃.Results：The linear response range from 4～40μg·mL-1（r=0.9999，n=6）of piperine；the average recoveries（n=9）of the method was 98.19%with RSD 0.86%. Conclusion：The method is simple，accurate，reproducible and stable，and can be used for the quality control of mongolian medicine preparation Hao Sen Bu Ru-13.

Mongolian medicine preparation HPLC Hao Sen Bu Ru-13 Piperine Determination

R917

A

1672-8351（2016）08-0002-02