于新友　李天芝

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 （LAMP）技術(shù)及其在豬繁殖障礙性疾病病原檢測(cè)中的應(yīng)用

于新友李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 （LAMP）技術(shù)是一門新興的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便和成本低等特點(diǎn)，越來(lái)越受到獸醫(yī)相關(guān)工作者的關(guān)注。目前，該方法己被廣泛應(yīng)用于各種豬病病原的檢測(cè)。本文對(duì)LAMP技術(shù)及其在豬繁殖障礙性疾病病原檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為今后豬繁殖障礙性疾病的診斷和防控工作提供參考。

LAMP；豬繁殖障礙性疾病；病原；檢測(cè)；應(yīng)用

豬繁殖障礙性疾病是指繁殖期內(nèi)公、母豬由于疾病因素引起的，以妊娠母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔、畸形仔，少仔和公母豬不育癥為主要特征的一類疾病總稱。近年來(lái)，豬的繁殖障礙性疾病問(wèn)題十分突出，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展。引起豬繁殖障礙性疾病的病原主要是病毒、細(xì)菌和寄生蟲。病毒主要包括豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬腦心肌炎病毒等。細(xì)菌單獨(dú)引起的豬繁殖障礙性疾病發(fā)生較少，主要由布魯氏桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、李氏桿菌、鉤端螺旋體、大腸桿菌、綠膿桿菌、豬丹毒桿菌等感染引起，主要引起散發(fā)性流產(chǎn)、死胎、子宮內(nèi)膜炎、乳房炎、陰道炎等。寄生蟲主要包括弓形蟲、附紅細(xì)胞體、豬冠尾線蟲等。豬繁殖障礙性疾病常由兩種以上的病原體共同作用或繼發(fā)感染造成，這增加了疾病診斷與防控的難度，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，養(yǎng)殖場(chǎng)主要是將病料送專業(yè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原分離鑒定或PCR檢測(cè)，一旦出現(xiàn)疫情，由于條件所限，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)疫病的快速檢測(cè)。日本學(xué)者Notomi等［1］開發(fā)了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）擴(kuò)增核酸的技術(shù)，該技術(shù)不需要模板的熱變性［2］、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳和紫外觀察等過(guò)程，整個(gè)反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，結(jié)果可用肉眼直接觀察，在疫病診斷領(lǐng)域顯示了廣闊的應(yīng)用前景。本文就LAMP技術(shù)及在豬繁殖障礙性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1 LAMP技術(shù)

LAMP技術(shù)是針對(duì)靶基因6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特殊引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在65℃左右溫度下，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，完成對(duì)目標(biāo)DNA的大量擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。

1.2 LAMP引物設(shè)計(jì)

首先在靶基因的5’末端和3’末端分別設(shè)定B1、B2、B3和F3c、F2c、F1c等區(qū)段。針對(duì)這六個(gè)區(qū)段設(shè)計(jì)四條引物，包括一對(duì)內(nèi)部引物和一對(duì)外部引物。上游內(nèi)部引物FIP：在3’末端含有與F2c互補(bǔ)的F2區(qū)段，在5’末端含有與F1c相同序列的區(qū)段。下游內(nèi)部引物BIP：在3’末端含有與B2c互補(bǔ)的B2區(qū)段，在5’末端含有與B1c相同序列的區(qū)段。上游外部引物F3：含有與目標(biāo)DNA上的F3序列相同的區(qū)段。下游外部引物B3：含有與目標(biāo)DNA的B3相同序列的區(qū)段，各引物組成及對(duì)應(yīng)區(qū)域如圖1所示。引物的設(shè)計(jì)要注意以下幾個(gè)問(wèn)題：①擴(kuò)增領(lǐng)域?yàn)镕2-B2區(qū)段間，該片段長(zhǎng)度最好小于200 bp。②包含F(xiàn)2/B2在內(nèi)的各環(huán)狀部分的長(zhǎng)度在40～60 bp范圍內(nèi)。③Tm值處于60～65℃之間。④若只是為了鑒定靶基因存在與否，F(xiàn)1-B1的間距可以為零。⑤引物應(yīng)避免二次結(jié)構(gòu)發(fā)生。⑥各引物的3’端不可含有與其他引物互補(bǔ)的序列。

圖1　LAMP的引物組成及對(duì)應(yīng)區(qū)域

1.3 LAMP技術(shù)特點(diǎn)

LAMP技術(shù)具有以下特點(diǎn)：①操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低，在恒溫條件先完成擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑，不需要提前對(duì)雙鏈DNA變性，適合在基層養(yǎng)殖場(chǎng)的推廣應(yīng)用。②擴(kuò)增的效率高，沒有PCR反應(yīng)中模板的退火、復(fù)性過(guò)程，在15～60分鐘內(nèi)可擴(kuò)增109～1010倍，能滿足臨床病料樣本快速檢測(cè)的需要。③特異性高，6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物序列不匹配均不能擴(kuò)增核酸。④靈敏度高，檢測(cè)的敏感性是常規(guī)PCR的10倍，擴(kuò)增模板可達(dá)10拷貝或更少。⑤僅使用一種鏈置換型BstDNA聚合酶，但BstDNA聚合酶必須在模板預(yù)變性以后再加入。⑥擴(kuò)增產(chǎn)物是在同一條DNA鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成大小不一的結(jié)構(gòu)。⑦對(duì)RNA模板樣品，只需加入逆轉(zhuǎn)錄酶就能像DNA模板樣品一樣進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

1.4反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)

LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)方法主要有五種：①以2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有典型的梯狀條帶判定結(jié)果。②用肉眼觀察擴(kuò)增產(chǎn)生的副產(chǎn)物—焦磷酸鎂白色沉淀的產(chǎn)生以直接判斷擴(kuò)增反應(yīng)是否進(jìn)行。③反應(yīng)體系中加入溴化乙錠、SYBR GreenⅠ等染料，通過(guò)觀察擴(kuò)增結(jié)果是否產(chǎn)生相應(yīng)顏色來(lái)判定是否有目的片段擴(kuò)增。④通過(guò)恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片實(shí)時(shí)觀察反應(yīng)結(jié)果。⑤運(yùn)用實(shí)時(shí)濁度儀監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)果。

4) 2017年12月19日，通過(guò)診斷系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)化工部供中沙(天津)石化公司抽余油流量計(jì)密度由680 kg/m3增到730 kg/m3，系統(tǒng)連續(xù)報(bào)警“驅(qū)動(dòng)增益超出量程”、“左檢測(cè)線圈超限錯(cuò)誤”，同時(shí)與下游表比對(duì)出現(xiàn)0.3%允差指標(biāo)，最大時(shí)達(dá)到0.74%。經(jīng)拆檢發(fā)現(xiàn)流量計(jì)出現(xiàn)嚴(yán)重掛壁，經(jīng)清洗后恢復(fù)正常。

2病毒類繁殖障礙性疾病病原檢測(cè)

2.1豬瘟病毒檢測(cè)

由CSFV引起的豬瘟是一種豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病，該病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大，且流行廣泛［3］，臨床上亞臨床感染和隱性感染增多，妊娠母豬帶毒綜合征病例突出，感染種豬外表健康，卻是豬瘟流行最危險(xiǎn)的傳染源。感染母豬所產(chǎn)仔豬伴隨高死亡率、弱仔、神經(jīng)癥狀等。張改平等［4］建立了CSFV的LAMP檢測(cè)方法，可區(qū)分豬瘟強(qiáng)毒和疫苗毒，檢測(cè)敏感性高，是常規(guī)RT-PCR的1 000倍，特異性好，對(duì)其他豬常發(fā)病原核酸無(wú)擴(kuò)增，進(jìn)一步驗(yàn)證顯示，該法同時(shí)有很好的重復(fù)性和特異性。鄭新添等［5］針對(duì)CSFV的NS3基因設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了快速檢測(cè)CSFV的LAMP方法，并對(duì)LAMP反應(yīng)體系、反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，評(píng)定其特異性和敏感性。結(jié)果表明：該方法可在65℃50分鐘內(nèi)快速擴(kuò)增CSFV，擴(kuò)增結(jié)果可通過(guò)可視的顏色判斷，LAMP反應(yīng)對(duì)PRV、PCV2、PRRSV等無(wú)交叉反應(yīng)，其檢測(cè)CSFV的最低濃度為13.6 fg/μL，對(duì)臨床樣品的檢出率高于RT-PCR技術(shù)。

2.2豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)

PRRSV引起的母豬繁殖障礙主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎，特別是妊娠母豬的后期流產(chǎn)，流產(chǎn)率可達(dá)30%以上，小豬的死亡率在35%～40%之間。傳播途徑很多，包括口腔、鼻腔、肌肉及生殖道。蒲靜等［6］針對(duì)PRRSV美洲型ORF6基因的6個(gè)區(qū)域，利用2對(duì)引物建立檢測(cè)PRRSV的RT-LAMP快速檢測(cè)方法，該方法具有高靈敏度、高特異性的優(yōu)點(diǎn)，在2小時(shí)左右即可得出結(jié)果，其靈敏度與PRRSV熒光RT-PCR檢測(cè)方法相近，高于普通RT-PCR檢測(cè)方法。將滅活的PRRSV美洲型培養(yǎng)物作10倍系列稀釋，結(jié)果顯示建立的熒光RT-PCR的檢測(cè)極限可達(dá)10-7，RT-PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)極限為10-5，RT-LAMP檢測(cè)方法達(dá)到10-8。羅忠永等［7］根據(jù)PRRSV M蛋白基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的LAMP引物，建立了PRRSV的快速檢測(cè)方法，結(jié)果表明，該法能在64.5℃60分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸片段的大量擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)直接觀察反應(yīng)副產(chǎn)物—焦磷酸鎂進(jìn)行判讀，該檢測(cè)系統(tǒng)具有很高的特異性，與CSFV、JEV等均無(wú)交叉反應(yīng)，通過(guò)PRRSV不同毒株疫苗、模擬樣品和臨床樣品確定，該檢測(cè)系統(tǒng)具有很好的穩(wěn)定性，通過(guò)質(zhì)粒確定該檢測(cè)系統(tǒng)可以檢測(cè)到10拷貝/μL的病毒核酸模板。

2.3豬偽狂犬病毒檢測(cè)

PRV可引起豬的偽狂犬病，各種日齡豬均可發(fā)病，初生仔豬可表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀和腹瀉，死亡率高達(dá)100%，懷孕母豬可表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、弱胎和木乃伊胎等。張莉等［8］根據(jù)PRV gE基因區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，建立了PRV的LAMP檢測(cè)方法，該法最低可檢測(cè)100個(gè)拷貝質(zhì)粒DNA量，對(duì)PRV強(qiáng)毒的檢測(cè)有很好的特異性，對(duì)PRRSV、PPV、CSFV、豬流感病毒和PRV gE基因缺失疫苗基因組擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。王樹芬等［9］將羅丹明B衍生物作指示劑在反應(yīng)前加到反應(yīng)緩沖液里，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立LAMP快速檢測(cè)PRV的方法，該法在63℃40分鐘即可完成全部擴(kuò)增反應(yīng)，肉眼觀察就能判定反應(yīng)結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物顏色為藍(lán)色時(shí)判定為陽(yáng)性，為紫色時(shí)判定為陰性。

2.4豬圓環(huán)病毒2型檢測(cè)

PCV2是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，還可以引起母豬的繁殖障礙，同時(shí)也是一種免疫抑制性疾病，常與其他疾病發(fā)生混合感染。楊澤曉等［10］建立了LAMP檢測(cè)PCV2的方法，64℃45分鐘即可完成擴(kuò)增反應(yīng)，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物為大于1 345 bp的梯狀條帶。該法特異性好，對(duì)PCV1、PPV、PRV、PRRSV 和CSFV核酸結(jié)果均為陰性。敏感性高，對(duì)模板DNA檢測(cè)量為10拷貝/μL，通過(guò)對(duì)60份臨床檢樣符合性檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果顯示，該法檢測(cè)結(jié)果與PCR完全一致。胡瑞麗等［11］根據(jù)PCV2的ORF2基因設(shè)計(jì)出3對(duì)特異性引物，擴(kuò)增PCV2基因的最佳溫度和時(shí)間優(yōu)化到59℃孵育55分鐘。用該方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，LAMP檢測(cè)對(duì)PCV2的檢測(cè)限為10拷貝/μL，而常規(guī)PCR檢測(cè)法的檢測(cè)限為1 000拷貝/μL，表明LAMP檢測(cè)法靈敏度高。該檢測(cè)法不會(huì)與PCV1、PRRSV、豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.5豬細(xì)小病毒檢測(cè)

PPV可引起母豬發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、產(chǎn)畸形胎、胎兒木乃伊化和不孕等，母豬本身沒有癥狀，初產(chǎn)母豬受到的危害最為嚴(yán)重。劉業(yè)兵等［12］建立了PPV的LAMP檢測(cè)方法，63℃45分鐘可完成檢測(cè)反應(yīng)。敏感性高，最低可檢測(cè)0.23 TCID50病毒量，特異性好，對(duì)其他病毒核酸無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，在反應(yīng)產(chǎn)物內(nèi)加入SYBR Green I肉眼判斷結(jié)果，與Real Time Turbidimeter LA-320儀監(jiān)測(cè)結(jié)果一致。陳星瑤等［13］建立了快速檢測(cè)PPV的LAMP方法，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，擴(kuò)增的溫度60℃、62℃、64℃和66℃均可以，最佳擴(kuò)增時(shí)間為45分鐘，最低可檢測(cè)10拷貝的PPV核酸模板量，特異性良好，對(duì)SS2、豬水泡病病毒、PRV、CSFV、豬流感病毒、O型口蹄疫病毒、PRRSV核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，在反應(yīng)產(chǎn)物內(nèi)加入SYBR GreenⅠ熒光染料，通過(guò)肉眼觀察結(jié)果，當(dāng)反應(yīng)產(chǎn)物顏色變?yōu)辄S綠色，判為陽(yáng)性，否則為陰性。

2.6豬乙型腦炎病毒檢測(cè)

乙腦是由JEV引起的一種人畜共患的自然疫源性傳染病，JEV主要通過(guò)蚊蟲叮咬傳播，豬是其主要傳染來(lái)源和擴(kuò)散宿主，可導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱仔，公豬睪丸炎，育肥豬持續(xù)高熱，新生仔豬呈神經(jīng)癥狀等。盧冰霞等［14］根據(jù)豬JEV E基因序列的保守區(qū)6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了4條特異性LAMP引物，以JEV陽(yáng)性樣品RNA為模板進(jìn)行一步法擴(kuò)增，并對(duì)反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，該方法具有較高的靈敏度，其檢測(cè)極限為0.5 pg，特異性試驗(yàn)表明其具有較高的特異性，對(duì)其他病毒性病原體均無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)。與RT-Nested-PCR相比，兩種方法檢出率的符合率為90.9%。反應(yīng)結(jié)束后可以通過(guò)添加化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行可視化觀察，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。周玉鵬等［15］根據(jù)Gen Bank中登錄的基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV毒株基因序列，分別設(shè)計(jì)了1套基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特異性RT-LAMP引物，并以此引物分別建立了基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特異性RT-LAMP方法。結(jié)果顯示，基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特異性RT-LAMP方法均能在1小時(shí)內(nèi)完成對(duì)相應(yīng)基因型JEV RNA的擴(kuò)增，并與CSFV、PRRSV、PCV2、PPV和PRV無(wú)交叉反應(yīng)。靈敏性試驗(yàn)結(jié)果顯示，基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV特異性RT-LAMP方法均能擴(kuò)增出24拷貝數(shù)的JEV RNA。

2.7豬腦心肌炎病毒檢測(cè)

豬腦心肌炎病毒感染可導(dǎo)致豬腦心肌炎，感染母豬臨床表現(xiàn)主要為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎。仔豬主要表現(xiàn)為心肌炎，死亡率可達(dá)100%。張嶺嶺等［16］針對(duì)EMCV 3D基因保守序列的6個(gè)特異性部位設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，利用Bst DNA聚合酶，63℃恒溫保持50分鐘即可完成反轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ染料，在紫外光下可直接觀察判定擴(kuò)增結(jié)果，試驗(yàn)成功建立了豬腦心肌炎病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該方法靈敏度比RT-PCR高100倍，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，而且對(duì)其他病毒均無(wú)擴(kuò)增結(jié)果，可作為豬腦心肌炎病毒的快速診斷方法。

3細(xì)菌類繁殖障礙性疾病病原檢測(cè)

3.1豬布魯氏桿菌檢測(cè)

布魯氏桿菌病是由布魯氏菌引起的世界五大人畜共患傳染病之一，不同品種和年齡的豬均易感，感染母豬可表現(xiàn)為流產(chǎn)、不孕、陰唇紅腫、陰道流出膿性分泌物，公豬主要表現(xiàn)為睪丸炎。許鄒亮等［17］針對(duì)布魯氏菌外膜蛋白OMP25基因設(shè)計(jì)引物，建立了布魯氏菌LAMP檢測(cè)方法，該法在反應(yīng)前加入染料羥基萘芬藍(lán)（HNB）作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增的指示劑，63℃恒溫反應(yīng)60分鐘，根據(jù)HNB的顏色變化進(jìn)行結(jié)果判定。結(jié)果顯示，該法最低檢出限約為17 fg布魯氏菌基因組DNA。特異性良好，豬大腸桿菌K99、巴氏桿菌C48-1、豬鏈球菌ST171、綠膿桿菌等對(duì)照組均未出現(xiàn)擴(kuò)增。

3.2豬金黃色葡萄球菌檢測(cè)

金黃色葡萄球菌感染可造成豬的急性、亞急性或慢性乳腺炎，壞死性葡萄球菌皮炎及乳房的膿皰病。蔡克周等［18］建立了豬金黃色葡萄球菌LAMP檢測(cè)方法，該法主要針對(duì)其femA基因設(shè)計(jì)引物，在水浴鍋中63℃30分鐘即可完成擴(kuò)增反應(yīng)，最終通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳判定反應(yīng)結(jié)果，對(duì)金黃色葡萄球菌的靈敏度為8.7 CFU/mL，高于常規(guī)PCR檢測(cè)方法，且有很好的特異性，對(duì)其他病原物擴(kuò)增反應(yīng)。

3.3豬鏈球菌血清2型檢測(cè)

豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病病原菌，各年齡段豬均可感染豬鏈球菌病。臨床主要表現(xiàn)為敗血癥、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等，也可導(dǎo)致懷孕母豬流產(chǎn)。

除病豬外，康復(fù)豬和健康豬也可帶菌，當(dāng)它們互相接觸，可通過(guò)口、鼻、皮膚傷口而傳染。自然感染的部位是上呼吸道、消化道和傷口。張九州等［19］根據(jù)豬鏈球菌2型莢膜多糖基因保守區(qū)域，設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了豬鏈球菌2型LAMP檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，該法敏感性高，最低可檢測(cè)鏈球菌基因組DNA的量為0.186 fg/μL，是常規(guī)PCR的1 000倍，對(duì)其他細(xì)菌擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，具有良好的特異性。

4寄生蟲類繁殖障礙性疾病病原檢測(cè)

弓形蟲引起的母豬繁殖障礙表現(xiàn)為高熱、食欲廢絕、昏睡、持續(xù)3～5天后發(fā)生流產(chǎn)或產(chǎn)出死胎、畸形胎。一旦流產(chǎn)后母豬即可解除高熱昏睡狀態(tài)。王玉嬌等［20］建立了豬弓形蟲病LAMP檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，該法在樣本DNA稀釋3×105倍后仍可檢出，該方法擴(kuò)增不出新孢子蟲、瑟氏泰勒蟲及豬附紅細(xì)胞體等病原體DNA，表明建立的LAMP方法具有靈敏、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，適合于豬弓形蟲病的檢測(cè)。豬附紅細(xì)胞體可引起豬的附紅細(xì)胞體病，該病臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、黃疸和貧血，感染母豬也可出現(xiàn)繁殖障礙性疾病，主要表現(xiàn)為發(fā)情不正常、受胎率不高、產(chǎn)弱胎和死胎等。李月梅等［21］建立了用LAMP技術(shù)檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體的方法，并對(duì)該法檢測(cè)的特異性和敏感性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，該法特異性好，對(duì)瑟氏泰勒蟲、新孢子蟲和弓形蟲核酸均無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，敏感性高，最低可檢測(cè)5×105倍稀釋的附紅細(xì)胞體DNA量，可用于臨床樣品的快速檢測(cè)。

5小結(jié)與展望

LAMP技術(shù)作為一種快速基因擴(kuò)增技術(shù)，自發(fā)明以來(lái)，在國(guó)內(nèi)外疾病、衛(wèi)生、食品及環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域都取得了重大成就，近年來(lái)受到了越來(lái)越多的關(guān)注，LAMP是整個(gè)過(guò)程均在恒溫條件下進(jìn)行、不需要昂貴儀器設(shè)備而易在基層部門普及的檢測(cè)技術(shù)，避免了常規(guī)PCR對(duì)于溫度循環(huán)的特殊要求所帶來(lái)的各種不便，可快速診斷疾病，從而采取措施，降低養(yǎng)殖場(chǎng)損失。但LAMP檢測(cè)技術(shù)同樣存在一些不足：一是LAMP對(duì)于引物設(shè)計(jì)要求很高，需要設(shè)計(jì)的引物數(shù)目多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。二是檢測(cè)靈敏度太高，易因空氣中的氣溶膠污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。三是在LAMP擴(kuò)增結(jié)果判定方面也存在一定的問(wèn)題，當(dāng)以瓊脂糖凝膠電泳法判定結(jié)果時(shí)，結(jié)果為梯形條帶，不易鑒別非特異性擴(kuò)增。當(dāng)以焦磷酸鎂白色沉淀和體系中添加染料法判定結(jié)果時(shí)，可能存在因結(jié)果顏色不明顯而造成肉眼觀察不便捷及誤判；另外，當(dāng)有非特異擴(kuò)增時(shí)，染料也可結(jié)合，影響結(jié)果判定。當(dāng)以微流控芯片和實(shí)時(shí)濁度儀法判定結(jié)果時(shí)，則需要購(gòu)置昂貴的分析儀器。隨著研究的不斷深入，研究人員還將其與原位雜交、免疫捕獲、核酸雜交等技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合，開發(fā)了很多有效的檢測(cè)方法，尤其是，發(fā)展起來(lái)的新的將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）與橫向流動(dòng)試紙條（LFD）聯(lián)合應(yīng)用，建立一種新的病原快速檢測(cè)技術(shù)，即LAMP-LFD技術(shù)，使得LAMP現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果的觀察更加方便、直觀和準(zhǔn)確，并解決了擴(kuò)增產(chǎn)物形成氣溶膠污染環(huán)境，導(dǎo)致樣品間交叉污染的問(wèn)題，開啟了基因檢測(cè)技術(shù)步入基層養(yǎng)殖場(chǎng)的應(yīng)用新時(shí)代，極具推廣前景。目前已經(jīng)有科研人員在CSFV的檢測(cè)方面進(jìn)行了一些探索，并取得了一定的成績(jī)。筆者認(rèn)為L(zhǎng)AMP-LFD技術(shù)是未來(lái)LAMP檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的方向，在一些基層實(shí)驗(yàn)室和流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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S858.28

A

1673-4645（2016）07-0050-05

2016-06-03

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-06-022-15）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2013CQ006）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2014CQ010）

于新友（1983-），男，漢族，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物傳染病診斷技術(shù)研究，E-mail：yuxinyou_2006@126.com