呂艷陽(yáng)，陳芳芳，查純婷

(信陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000)

0 引言

蒲公英為菊科多年生草本植物，由于蒲公英中的植物活性成分含有黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)物質(zhì)及植物甾醇等，故有一定的藥用價(jià)值，比如抑菌、解毒、抗氧化、抗腫瘤、通乳、提高免疫力、降低血糖等[1-4].現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床各科，如急性乳腺炎、呼吸道感染、淋巴結(jié)炎[5]等多種感染性炎癥.牛血清白蛋白(BSA)由580個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈蛋白質(zhì)，其中包括能夠發(fā)出內(nèi)源性熒光的色氨酸殘基、酪氨酸殘基、苯丙氨酸殘基等[6-8].BSA的氨基酸序列與人血清白蛋白(HSA)的氨基酸序列高度相似，并且BSA具有相對(duì)分子質(zhì)量小、溶解度大、性質(zhì)穩(wěn)定、廉價(jià)易得的優(yōu)點(diǎn).為了研究藥物與人血清白蛋白相互結(jié)合情況，所以人們經(jīng)常研究藥物與BSA的相互作用，因此具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值.目前，關(guān)于天然藥物蒲公英與牛血清白蛋白相互作用的研究報(bào)道較少，本文利用熒光光譜法研究了蒲公英提取物與牛血清白蛋白BSA的相互作用，探討了不同濃度的蒲公英提取物和溶劑種類(lèi)這兩個(gè)因素對(duì)熒光強(qiáng)度的影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)，美國(guó)瓦里安公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞兒電器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司.甲醇、95%乙醇、鹽酸、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)(以上試劑均為分析純)，牛血清白蛋白(BSA，分子量為67 000，生化試劑)，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水.蒲公英于2015年4月7日清晨采自信陽(yáng)師范學(xué)院.

1.2 溶液的配制

0.100 0 mol/LTris溶液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)量三(羥甲基)氨基甲烷3.028 9 g，配成250 mL水溶液.

0.100 8 mol/L的HCl溶液的配制：用移液管準(zhǔn)確移取2.1 mL濃鹽酸至250 mL容量瓶中，然后加蒸餾水定容.

1.0×10-4mol/L BSA水溶液的配制：稱(chēng)量0.335 7 g，分子量為67 000 g/mol的牛血清白蛋白，加蒸餾水使之完全溶解，然后定容至50 mL容量瓶中.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蒲公英預(yù)處理

將新鮮的蒲公英洗凈，去除根.將蒲公英花、葉分離并剪碎.稱(chēng)量20 g蒲公英花、蒲公英葉，分別加入100 mL甲醇、95%乙醇進(jìn)行水浴回流，分別得到蒲公英花、葉甲醇提取液和蒲公英花、葉95%乙醇提取液.然后稀釋得到濃度為0.2 g/L的蒲公英花、葉甲醇分析試液，20 g/L的蒲公英花、葉95%乙醇分析試液.

1.3.2 相互作用的熒光發(fā)射光譜

在10 mL比色管中依次加入0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 mL蒲公英花(或葉)甲醇分析試液，1.5 mL鹽酸溶液，0.5 mLTris 溶液(pH=7.6)，濃度為1×10-4mol/L的BSA水溶液1 mL.最后加入蒸餾水定容至10 mL.混合均勻后靜止放置10 min，以280 nm為熒光激發(fā)波長(zhǎng)，用Cary Eclipe 型熒光光譜儀在300～500 nm 范圍內(nèi)掃描其熒光發(fā)射光譜，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

在10 mL比色管中依次加入0、1、2、3、4、5、6、7 mL蒲公英花(或葉)95%乙醇分析試液，1.5 mL鹽酸溶液，0.5 mL Tris 溶液(pH=7.6)，濃度為1×10-4mol/L的BSA水溶液1 mL.最后加入蒸餾水定容至10 mL.混合均勻后靜止放置10 min，以280 nm為熒光激發(fā)波長(zhǎng)，用Cary Eclipe 型熒光光譜儀在300～500 nm 范圍內(nèi)掃描其熒光發(fā)射光譜，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 蒲公英提取液濃度對(duì)熒光光譜的影響

按1.3.2實(shí)驗(yàn)方法，分別改變蒲公英花、葉甲醇提取液，蒲公英花、葉乙醇提取液的濃度范圍，并分別掃描4種蒲公英提取液與BSA相互作用的熒光發(fā)射光譜，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2.

圖1 蒲公英花甲醇提取液與BSA的熒光發(fā)射光譜Fig.1 Fluorescence emission spectra of methanol extract of dandelion and BSA圖中從1到9曲線(xiàn)蒲公英甲醇提取液的濃度依次為：0、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11 g/L，Slit=5.0/5.0

圖2 蒲公英花乙醇提取液與BSA的熒光發(fā)射光譜Fig.2 Fluorescence emission spectra of ethanol extract of dandelion and BSA圖中從1到8曲線(xiàn)蒲公英乙醇提取液的濃度依次為：0、2、4、6、8、10、12、14 g/L，Slit=5.0/5.0

由圖1可以看出，在一定的蒲公英花甲醇提取液濃度范圍內(nèi)，其提取液會(huì)使BSA的熒光增強(qiáng)，且其熒光強(qiáng)度隨著蒲公英花甲醇提取液濃度的增加而增加.BSA的熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)隨著其濃度的增加無(wú)明顯紅移.蒲公英葉甲醇提取液也有類(lèi)似現(xiàn)象.該結(jié)果表明，蒲公英花、葉甲醇提取液與BSA分子中能夠產(chǎn)生內(nèi)源熒光的色氨酸殘基發(fā)生了相互作用，其微環(huán)境發(fā)生了變化，以及受分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)的影響[6]，從而使其熒光強(qiáng)度增強(qiáng).

由圖2可以看出，在一定的蒲公英花乙醇提取液濃度范圍內(nèi)，蒲公英花乙醇提取液均使BSA熒光猝滅，且其熒光強(qiáng)度隨著蒲公英花乙醇提取液濃度的增加而降低，BSA的熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)隨著蒲公英花乙醇提取液濃度的增加而明顯紅移.蒲公英葉乙醇提取液也有類(lèi)似現(xiàn)象.該結(jié)果表明，BSA發(fā)出的內(nèi)源熒光強(qiáng)度的降低不僅是由于其殘基所處微環(huán)境的變化，還受分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)與熒光猝滅效應(yīng)的影響，BSA熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)的紅移是由于BSA分子中Trp殘基[7]區(qū)域的疏水性減弱，導(dǎo)致BSA中熒光發(fā)色團(tuán)本身及周?chē)h(huán)境極性增加.

2.2 熒光強(qiáng)度增值與蒲公英提取液濃度變化關(guān)系

蒲公英提取液與BSA相互作用的熒光強(qiáng)度增值隨其濃度的變化關(guān)系如圖3和圖4所示.

圖3 蒲公英花甲醇提取液與BSA相互作用的熒光強(qiáng)度增值隨其濃度的變化圖Fig.3 A graph of the fluorescence intensity value-added of methanol extract of dandelion and BSA interaction over its concentration

由圖3可以看出，隨著蒲公英花甲醇提取液濃度的增加，其與BSA相互作用的熒光強(qiáng)度增值也增加，基本呈線(xiàn)性增加關(guān)系.蒲公英葉甲醇提取液也是如此.

圖4 蒲公英花乙醇提取液與BSA相互作用的熒光強(qiáng)度增值隨其濃度的變化圖Fig.4 A graph of the fluorescence intensity value-added of ethanol extract of dandelion and BSA interaction over its concentration

由圖4可以看出，蒲公英花乙醇提取液與BSA相互作用的熒光強(qiáng)度增值隨其濃度的增加呈線(xiàn)性減少的關(guān)系.蒲公英葉乙醇提取液也是如此.

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)蒲公英提取物與BSA的相互作用的熒光光譜的研究，發(fā)現(xiàn)：蒲公英花、葉甲醇提取物使BSA的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，且其最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)無(wú)明顯紅移；蒲公英花、葉乙醇提取物使BSA的熒光產(chǎn)生猝滅，且其最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)明顯紅移；甲醇溶劑的熒光強(qiáng)度隨著其體積增加而增加，影響較大，乙醇則基本不變.蒲公英花或者葉甲醇提取液與BSA相互作用的熒光強(qiáng)度增值與其濃度的增加呈線(xiàn)性增加關(guān)系.蒲公英花乙醇提取液與BSA相互作用的熒光強(qiáng)度增值與其濃度的增加呈線(xiàn)性下降趨勢(shì).蒲公英葉乙醇提取液與BSA相互作用的熒光強(qiáng)度增值與其濃度的增加呈平滑下降趨勢(shì).