徐 勝，束 軍，李曉峰，程 宇，沈繼龍

miRNA-16對肺腺癌A549細(xì)胞增殖和VEGF-A表達(dá)水平的影響

徐 勝1，束 軍1，李曉峰1，程 宇1，沈繼龍2

目的 探討miRNA-16作用不同時(shí)間對體外培養(yǎng)的人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響，以及對VEGF-A表達(dá)水平的影響。方法 將50 nmol/L的miRNA-16和陰性對照序列用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染進(jìn)人肺腺癌A549細(xì)胞中，通過qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中miRNA-16的表達(dá)水平，MTT法檢測轉(zhuǎn)染miRNA-16后細(xì)胞的增殖抑制情況，ELISA法檢測轉(zhuǎn)染m iRNA-16后細(xì)胞VEGF-A表達(dá)水平。結(jié)果 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后，測得轉(zhuǎn)染組miRNA-16表達(dá)水平明顯高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率明顯高于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞VEGF-A表達(dá)水平較陰性對照組和空白對照組明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論 miRNA-16能引起細(xì)胞增殖抑制，并且可能與下調(diào)VEGF-A的表達(dá)有關(guān)。

肺腺癌；VEGF-A；miRNA-16；細(xì)胞增殖

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-3-8 8：29：01 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.014.htm l

肺癌是當(dāng)今世界男性、發(fā)達(dá)國家女性癌癥引起的死亡原因最高的病種，在發(fā)展中國家女性病死率僅次于乳腺癌［1］。其發(fā)病率在中國也呈逐年上升趨勢，造成了沉重的社會負(fù)擔(dān)。非小細(xì)胞肺癌包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌等，占肺癌總數(shù)的80%。而肺腺癌又是占比最多的非小細(xì)胞肺癌類型。微小RNA（miRNAs）在人類多種疾病特別是癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色，通過對基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)對癌細(xì)胞增殖、凋亡等進(jìn)程的影響，從而在腫瘤生長、侵襲及遷移方面發(fā)揮重要作用。該研究旨在探討miRNA-16對血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-A是否存在作用，以及是否通過這種作用引起肺腺癌A549細(xì)胞增殖情況發(fā)生變化。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器 人肺腺癌A549細(xì)胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。hsa-miRNA-16 mimics和陰性對照以及miRNA-16 qPCR Quantitation Kit和U6 snRNA qPCR Normalization Kit均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。hsa-miRNA-16 mimics上游引物：5′-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3′，下游引物：5′-CCAAUAUUUACGUGCUGCUAUU-3′；陰性對照上游引物：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游引物：5′-ACGUGACACGUUC GGAGAATT-3′。胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；MTT、DMSO購自美國 Sigma公司；人 VEGF-A ELISA試劑盒購自上海源葉生物有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；無菌無酶槍頭購自美國Axygen公司；TRIzol試劑購自杭州諾唯贊公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司；ELX800UV酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司；ABI PRISM 7300熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；NanoDrop 2000c超微量紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo公司；電熱恒溫水浴鍋購自上海天平儀器有限公司；超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細(xì)胞株用含2 mmol/L的谷氨酰胺和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合至覆蓋瓶底80%～90%時(shí)用胰酶消化并反復(fù)吹打，分瓶傳代培養(yǎng)。

1.3qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染miRNA-16后肺腺癌A549細(xì)胞miRNA-16的表達(dá)水平 取對數(shù)生長期細(xì)胞（2×105/孔）接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到50%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染miRNA-16 mimics濃度為50 nmol/L。轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分3組，轉(zhuǎn)染了miRNA-16 mimics的細(xì)胞（轉(zhuǎn)染組），轉(zhuǎn)染了陰性對照序列的細(xì)胞（陰性對照組），未做轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞（空白對照組）。轉(zhuǎn)染后置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后去掉含轉(zhuǎn)染液的培養(yǎng)基。加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后，開始提取RNA。提取RNA的步驟按照TRIzol說明書進(jìn)行。在紫外分光光度儀上測吸光度（absorbance，A）值，A260及 A280值。計(jì)算RNA濃度和純度。計(jì)算A260/A280，取其值在1.8～2.0之間用于qRT-PCR法檢測。實(shí)驗(yàn)分逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增兩個(gè)階段。反應(yīng)以U6做內(nèi)參。逆轉(zhuǎn)錄為20μl反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25℃、30 min，42℃、30 min，85℃、5 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：、95℃預(yù)變性3 min；PCR反應(yīng)階段為95℃、12 s，62℃、40 s，共40個(gè)循環(huán)。通過qRT-PCR儀進(jìn)行檢測，得出Ct值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算以U6為內(nèi)參，空白對照組為基準(zhǔn)，ΔCt=（hsa-miR-16）Ct-（U6）Ct，ΔΔCt=［（hsa-miR-16）Ct-（U6）Ct］轉(zhuǎn)染組-［（hsa-miR-16）Ct-（U6）Ct］空白對照組，表達(dá)水平按照2-ΔΔCt計(jì)算。

1.4MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖抑制情況

0.25%胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，終止消化后1 000 r/ min離心5 min收集，用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至5×104/ml。實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組。取每孔100μl接種于96孔板。邊緣孔加無菌PBS。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后分別在24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測。每孔內(nèi)加入10μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，形成結(jié)晶后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，搖床振蕩10 min，置于酶標(biāo)儀于490 nm處檢測光密度（optical density，OD）值。每組設(shè)置5個(gè)副孔，組內(nèi)取平均值。比較組間差異，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5ELISA法檢測上清中VEGF-A的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h后，收集空白對照組、陰性對照組以及轉(zhuǎn)染組的肺腺癌A549細(xì)胞上清液。從4℃冰箱取出ELISA試劑盒，室溫放置30 min，按照說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，將其配制成不同濃度，檢測時(shí)設(shè)空白孔、待測樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔。待測樣品即3組A549細(xì)胞的上清液，以空白孔作為調(diào)零，然后使用酶標(biāo)儀在450 nm處進(jìn)行各孔OD值的測定，通過EXCEL工作表繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，再根據(jù)各樣品孔的OD值按照曲線方程計(jì)算出各個(gè)樣品濃度值。該檢測方法的靈敏度為1 pg/ml（最低檢測濃度小于1 pg/m l）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示。多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較比較采用SNK-q檢驗(yàn)。時(shí)間因素對MTT實(shí)驗(yàn)的影響采用重復(fù)測量資料的方差分析。

2　結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染m iRNA-16對于細(xì)胞內(nèi)m iRNA-16表達(dá)水平的影響 轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)miRNA-16表達(dá)水平與陰性對照組和空白對照組比較明顯升高。其表達(dá)水平約為空白對照組的（467.59±35.47）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 407.149，P＜0.05）。而陰性對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

圖1　轉(zhuǎn)染24 h后各組　A549細(xì)胞內(nèi)　m iRNA-16表達(dá)水平A：轉(zhuǎn)染組；B：陰性對照組；C：空白對照組；與陰性對照組比較：*P＜0.05；與空白對照組比較：#P＜0.05

2.2轉(zhuǎn)染m iRNA-16對細(xì)胞增殖的影響 為了研究轉(zhuǎn)染miRNA-16后細(xì)胞增殖是否受到抑制，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測miRNA-16對于細(xì)胞增殖的影響。轉(zhuǎn)染24、48、72 h后檢測3組OD值，見表1。經(jīng)球形檢驗(yàn)χ2=1.981，P=0.371，表明符合球形分布，以一元方差結(jié)果為準(zhǔn)。不同測試時(shí)間點(diǎn)間OD值不同，受時(shí)間影響（F=1037，P＜0.05）。測試時(shí)間組與組別間有交互作用（F=53.212，P＜0.05）。組別間OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=145.455，P＜0.05）。同時(shí)間點(diǎn)miRNA-16轉(zhuǎn)染組的OD值明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F24h= 70.234、F48h=181.009、F72h=1 211.030，P＜0.05）。而陰性對照組和空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3A549細(xì)胞上清液中VEGF-A含量的檢測

轉(zhuǎn)染48 h后，檢測各組VEGF-A濃度結(jié)果可得：空白對照組（146.43±7.71）pg/ml，陰性對照組（152.07±6.41）pg/m l，轉(zhuǎn)染組（55.56±6.04）pg/ m l。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清液中有少量的VEGF-A表達(dá)，且與空白對照組和陰性對照組相比顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=192.59，P＜0.05），空白對照組和陰性對照組比較VEGF-A表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

表1　轉(zhuǎn)染m iRNA-16 m im ics對A549細(xì)胞24、48、72 h增殖的影響（n=5，±s）

表1　轉(zhuǎn)染m iRNA-16 m im ics對A549細(xì)胞24、48、72 h增殖的影響（n=5，±s）

與陰性對照組比較：*P＜0.05；與空白對照組比較：#P＜0.05

OD值組別24 h　48 h　72 h空白對照0.567±0.025　0.688±0.022　0.907±0.018陰性對照　0.561±0.020　0.678±0.026　0.895±0.019轉(zhuǎn)染　0.471±0.028*#　0.543±0.021*#　0.623±0.016*#

圖1　轉(zhuǎn)染　m iRNA-16后各組細(xì)胞上清液中VEGF-A表達(dá)水平A：空白對照組；B：陰性對照組；C：轉(zhuǎn)染組；與空白對照組比較：*P＜0.05；與陰性對照組比較：#P＜0.05

3　討論

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%［2］，肺腺癌占非小細(xì)胞肺癌的比例逐年升高，現(xiàn)已超過肺鱗癌成為最大的一類非小細(xì)胞肺癌。大多數(shù)的肺癌患者在最終確診時(shí)已處于癌癥晚期，發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，失去了最佳治療時(shí)機(jī)。盡管疾病監(jiān)控與臨床治療措施取得了很大的進(jìn)展，但是患者術(shù)后5年生存率卻依然在30%～60%。潛在的調(diào)節(jié)肺癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制成為相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。

miRNAs是一大類存在于生物體內(nèi)長約19～22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，通過結(jié)合靶mRNA 的3′-UTR，導(dǎo)致翻譯停滯或者mRNA的降解，從而達(dá)到抑制基因表達(dá)的效果，是一種基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。既往大量研究表明，miRNAs與多種疾病的調(diào)節(jié)有關(guān)，在多種腫瘤如肝癌、結(jié)腸癌［3］以及結(jié)締組織病如骨性關(guān)節(jié)炎［4］中均有異常表達(dá)，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制、侵襲性和轉(zhuǎn)移能力下降等生物學(xué)行為，從而在癌癥發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演重要作用。在肺癌領(lǐng)域也有關(guān)于miRNAs的作用研究。Let-7是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)在肺癌中表達(dá)失調(diào)的miRNA。Takamizawa etal［5］曾報(bào)道Let-7在肺癌中的表達(dá)通常是下降的。miRNA-152能引起非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖抑制、凋亡、抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲等［6］。

既往曾有關(guān)于miRNA-16在卵巢癌［7］和慢性粒細(xì)胞性白血?。?］中的研究，亦有一項(xiàng)研究［9］表明miRNA-16在肺癌組織中的表達(dá)較自身的健康肺組織中的表達(dá)是下調(diào)的。為了研究轉(zhuǎn)染后非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞內(nèi)miRNA-16表達(dá)水平是否升高，本研究通過qRT-PCR法檢測得出轉(zhuǎn)染miRNA-16 mimics的細(xì)胞miRNA-16表達(dá)水平明顯高于空白對照組。為了研究miRNA-16高表達(dá)對于細(xì)胞增殖是否有抑制作用，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測顯示轉(zhuǎn)染組和空白對照組相比細(xì)胞增殖明顯受抑制。

血管能為腫瘤的生長提供所需營養(yǎng)物質(zhì)，而腫瘤在生長過程中也會有大量新生血管生成，這是內(nèi)皮細(xì)胞遷移并增殖產(chǎn)生的結(jié)果，大量新生血管的形成也導(dǎo)致了腫瘤的快速生長。腫瘤的血液轉(zhuǎn)移是轉(zhuǎn)移的主要途徑之一，能使癌細(xì)胞擴(kuò)散至其它器官引起癌變。通過抑制新生血管的形成來達(dá)到治療惡性腫瘤的目的已成為近些年研究熱點(diǎn)之一。VEGF是目前公認(rèn)的最強(qiáng)也是最有效的一種促血管生長的特異性因子。VEGF家族主要分為 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E五大類。其中VEGF-A基因位于6號染色體的6q21上，主要作用是促進(jìn)血管內(nèi)皮生長［10］。研究［11］表明，VEGF能直接刺激非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。通過targetscan等miRNA靶基因預(yù)測軟件，分析 VEGF-A可能是 miRNA-16靶基因。為了驗(yàn)證這一分析推斷，本研究采用ELISA法檢測了經(jīng)轉(zhuǎn)染miRNA-16的細(xì)胞的VEGFA表達(dá)水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組較空白對照組明顯下降。

通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推斷，miRNA-16可能通過抑制A549細(xì)胞內(nèi)VEGF-A的表達(dá)而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)。該結(jié)果也提示miRNA-16可能是一種抑癌基因，與miRNA-16在其它系統(tǒng)的腫瘤疾病的研究結(jié)果一致。但是miRNAs是一大類RNA，其所能調(diào)控的靶mRNA也紛繁復(fù)雜，VEGF-A也可以被其它miRNA所調(diào)控。故而miRNA-16在肺腺癌A549細(xì)胞中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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Effect of m iRNA-16 on proliferation and expression of VEGF-A in A549 cells

Xu Sheng，Shu Jun，Li Xiaofeng，et al
（Deptof Respiratory Medicine，The Fourth Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective To observe the effects ofmiRNA-16 on the proliferation and expression of VEGF-A of A549 cells.Methods Human lung adenocarcinoma A549 cells were transfected with 50 nmol/L miRNA-16 mimics or negative controlwith Lipofectamine 2000.24 hours after transfection，the expression level ofmiRNA-16 wasmeasured using qRT-PCR.Cell proliferation wasmeasured by methylthiazol tetrazolium（MTT）assays.The expression level of VEGF-A was tested with enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Resu lts The expression level of miRNA-16 in A549 cellswas significantly up-regulated compared with the blank control group and negative control group（P＜0.05）.The proliferation of A549 cellswas obviously inhibited（P＜0.05）.The expression of VEGF-A in A549 cellswas decreased inmiRNA-16 mimics group conpared with other two groups（P＜0.05）.Conclusion

lung adenocarcinoma；VEGF-A；miRNA-16；cell proliferation

R 734.2

A

1000-1492（2016）04-0489-04

2016-01-08接收

安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號：1308085MH141）；

安徽醫(yī)科大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目（編號：2010xkj115）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，合肥 2300222安徽病原生物學(xué)省級實(shí)驗(yàn)室和人獸共患病安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，合肥230032

徐 勝，男，碩士研究生；

束 軍，男，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：J. Shu@126.com

The results indicate thatmiRNA-16 inhibits the proliferation of A549 cells，which might be associated with the down-regulation of the reduced expression of VEGF-A.