徐建國(guó),楊 超,邢 新,戴海英,方 碩,孫肇晟

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實(shí)驗(yàn)研究

上調(diào)miR-206對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和侵襲能力的影響

徐建國(guó),楊 超,邢 新,戴海英,方 碩,孫肇晟

目的 研究上調(diào)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞miR-206水平對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響。方法 通過(guò)CD31磁珠提取嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-206模擬物提高HemECs細(xì)胞內(nèi)miR-206水平，研究miR-206對(duì)該細(xì)胞功能的影響。以cck-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的改變，AV-PI凋亡試劑盒經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡水平變化，并經(jīng)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲能力變化。結(jié)果 轉(zhuǎn)染miR-206模擬物進(jìn)入HemECs細(xì)胞內(nèi)48 h后，能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，抑制率為(34.2±6.8)%；轉(zhuǎn)染48 h后相比于對(duì)照組(1.7±1.6)%的凋亡細(xì)胞比率，miR-206模擬物組細(xì)胞凋亡比率提高到(23.9±5.1)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染后24 h侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞穿透Transwell小室至下室面細(xì)胞數(shù)在對(duì)照組為30.3±2.4，在miR-206模擬物組細(xì)胞數(shù)減少至14.3±3.0。結(jié)論 上調(diào)HemECs細(xì)胞內(nèi)miR-206水平可明顯抑制細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡水平，減少細(xì)胞侵襲能力。提示miR-206可能通過(guò)調(diào)節(jié)瘤體細(xì)胞生物活性，對(duì)嬰幼兒血管瘤疾病進(jìn)程起到重要的調(diào)控作用。

嬰幼兒血管瘤； miR-206； 內(nèi)皮細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞侵襲

嬰幼兒血管瘤(Infantile hemangioma,IH)是兒童最常見(jiàn)的良性腫瘤，高加索人種新生兒發(fā)病率在4%～10%[1]，女?huà)敫装l(fā)病，男女比例約為1.0∶2.3[2]，亞裔人群發(fā)病率相對(duì)偏低，但尚未見(jiàn)準(zhǔn)確流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)。嬰幼兒血管瘤發(fā)病機(jī)制不明，一般認(rèn)為具有增生期、消退期和消退完成期3個(gè)時(shí)期的獨(dú)特病程發(fā)展過(guò)程，具有自發(fā)消退特性是其獨(dú)特的病程特征。嬰幼兒血管瘤增生期快速增生的分子機(jī)制，可能是由于主體細(xì)胞嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(infantile hemangioma endothelial cells，HemECs)內(nèi)C482R和TEM8基因突變，導(dǎo)致VEGFR2/TEM8/β1整合素復(fù)合物異常，引發(fā)VEGFR2信號(hào)通路活性增強(qiáng)和VEGFR1信號(hào)通路活性減弱，從而刺激HemECs大量快速增生[3]。而嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和瘤體細(xì)胞的分化轉(zhuǎn)化，可能是瘤體轉(zhuǎn)向消退的重要原因[4]。自2012年1月至2013年12月，筆者研究了miR-206在嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的作用，以了解嬰幼兒血管瘤病程的發(fā)展機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)和分組 共收集經(jīng)病理確診的嬰幼兒血管瘤增生期標(biāo)本7例，標(biāo)本來(lái)源于第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院整形外科。均獲患者家屬知情同意，并通過(guò)長(zhǎng)海醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。借鑒馬剛等的技術(shù)方法[5]，自7例增生期標(biāo)本中獲取HemECs細(xì)胞，獲取方法大致如下：標(biāo)本組織切至約1 mm×1 mm×1 mm后，采用0.2%膠原酶Ⅰ(美國(guó)SIGMA公司)于37℃消化40 min后，細(xì)胞過(guò)濾，形成的單細(xì)胞懸液采用CD31磁珠試劑盒(德國(guó)MILTENYI公司)進(jìn)行陽(yáng)選細(xì)胞磁珠分選得嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(hemangioma endothelial cells, HemECs)；分選后細(xì)胞接種于500 ng/ml纖維黏連蛋白鋪底的培養(yǎng)皿中，以EGM-2MV培養(yǎng)基(瑞士LONZA公司，包含VEGF、bFGF、EGF、IGF、肝素、VitC、氫化可的松等)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。細(xì)胞獲取后通過(guò)形態(tài)、攝取Dil-Ac-LDL能力、表面CD31標(biāo)記物、vWF標(biāo)記物檢測(cè)以及成管實(shí)驗(yàn)鑒定。細(xì)胞傳代2、3代并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，平鋪于6孔板，各標(biāo)本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分空白組、陰性對(duì)照組、miR-206模擬物轉(zhuǎn)染組。按Lipofectamine?RNAiMAX Reagent (美國(guó)lIFE TECHNOLOGIES公司)說(shuō)明書(shū)對(duì)miR-206模擬物轉(zhuǎn)染組HemECs細(xì)胞進(jìn)行miR-206 mimics轉(zhuǎn)染，陰性對(duì)照組以常用參照物miR-67進(jìn)行轉(zhuǎn)染，miR-206 mimics正義鏈序列(5＇-3＇)：UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG；反義鏈序列(5＇-3＇):CCACACACUUCCUUACAUUCCA(上海拓然生物有限公司)。

1.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-206的表達(dá) 各組細(xì)胞6孔板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染miRNAs 48 h后采用mirVana PARIS Kit(美國(guó)lIFE TECHNOLOGIES公司)提取各細(xì)胞總RNA，依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。采用TaqMan探針引物，由llIFE TECHNOLOGIES公司設(shè)計(jì)合成，引物編號(hào)(Assay ID：000510)。以U6 snRNA(Assay ID ：001973)為內(nèi)參，細(xì)胞以陰性對(duì)照組為對(duì)照，計(jì)算各組對(duì)應(yīng)的2-△△Ct值?！鳌鰿t計(jì)算公式如下：

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 以3例標(biāo)本中分離培養(yǎng)的HemECs細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，每例標(biāo)本細(xì)胞分空白組、陰性對(duì)照組、miR-206模擬物轉(zhuǎn)染組。細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板內(nèi)，每例標(biāo)本細(xì)胞各組設(shè)技術(shù)重復(fù)3孔，測(cè)定值取平均值，并設(shè)轉(zhuǎn)染后24 h和48 h兩板，加入cck-8試劑(同仁化學(xué)研究所，日本)10 μl，37℃孵育2 h后，以ELX800UV酶標(biāo)儀(美國(guó)BIOTEK公司)檢測(cè)細(xì)胞活性。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算方法如下：

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 以3例標(biāo)本中分離培養(yǎng)的HemECs細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，每例標(biāo)本細(xì)胞均分為空白組、陰性對(duì)照組、miR-206模擬物轉(zhuǎn)染組。每例標(biāo)本細(xì)胞各組設(shè)技術(shù)重復(fù)3孔，細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板內(nèi)，轉(zhuǎn)染后24 h通過(guò)ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基生物技術(shù)公司)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 以3例標(biāo)本中分離培養(yǎng)的HemECs細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分空白組、陰性對(duì)照組、miR-206模擬物轉(zhuǎn)染組。每例標(biāo)本細(xì)胞于6孔板內(nèi)培養(yǎng)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染12 h后消化接種于鋪有matrigel膠的Transwell小室內(nèi)，內(nèi)室以EGM-2無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，外室以10%FBS的EGM-2MV培養(yǎng)基作為趨化培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 h后，以0.1%結(jié)晶紫染色法進(jìn)行Transwell小室下室面細(xì)胞染色檢測(cè)。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法在高倍鏡下勻稱(chēng)選取中間及上下左右共5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 HemECs分離培養(yǎng)及鑒定 經(jīng)CD31偶聯(lián)磁珠分選后培養(yǎng)細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞4 h左右貼壁生長(zhǎng)。因原代生長(zhǎng)較慢，故傳代后具有快速增殖能力，細(xì)胞接觸抑制較其他細(xì)胞不明顯。生長(zhǎng)過(guò)旺，細(xì)胞間積壓后呈長(zhǎng)梭形。分離細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)、攝取Dil-Ac-LDL能力、表面CD31標(biāo)記物、vWF標(biāo)記物檢測(cè)以及成管能力檢測(cè)鑒定。培養(yǎng)細(xì)胞及鑒定見(jiàn)圖1。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-206的表達(dá) miR-206模擬物轉(zhuǎn)染后8 h，miR-206模擬物轉(zhuǎn)染組miR-206相對(duì)量水平(8.01±1.30)明顯高于陰性對(duì)照組(1.05±0.36)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

2.3 HemECs細(xì)胞內(nèi)miR-206水平對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響 通過(guò)cck-8試劑對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行增殖能力檢測(cè)，與對(duì)照組比較可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯改變，轉(zhuǎn)染miR-206 模擬物組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞數(shù)量明顯偏低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞增殖抑制率為(34.2±6.8)%，見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，miR-206水平的提高，對(duì)HemECs細(xì)胞的增殖能力有明顯的抑制作用。

2.4 HemECs細(xì)胞內(nèi)miR-206水平對(duì)細(xì)胞凋亡水平的影響 HemECs細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行細(xì)胞收集。通過(guò)ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行凋亡水平的流式細(xì)胞儀檢測(cè)。轉(zhuǎn)染miR-206模擬物后，HemECs細(xì)胞凋亡水平明顯增高。陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡比率為(1.7±1.6)%，miR-206模擬物組細(xì)胞凋亡比率為(23.9±5.1)%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 HemECs細(xì)胞內(nèi)miR-206水平對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞無(wú)明顯差異，說(shuō)明轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞侵襲力改變無(wú)明顯影響。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法為高倍鏡下，勻稱(chēng)選取中間及上下左右共5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。與陰性對(duì)照組下室面細(xì)胞數(shù)30.3±2.4相比，轉(zhuǎn)染miR-206模擬物組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24 h，穿透matrigel膠進(jìn)入Transwell小室下室面細(xì)胞明顯減少為14.3±3.0，侵襲能力明顯減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 嬰幼兒血管瘤CD31磁珠陽(yáng)選細(xì)胞鑒定 a. 細(xì)胞種板后24 h細(xì)胞明顯開(kāi)始分裂生長(zhǎng)，呈鋪路石樣改變 b. 分離細(xì)胞與Dil-Ac-LDL共培養(yǎng)4 h后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)明顯Dil的紅色熒光顆粒，提示細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞的吞脂功能 c. DAPI染核CD31和vWF共標(biāo)記后細(xì)胞顯影，提示分離細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞的CD31和vWF雙表達(dá) d. 分離細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，在Matrigel膠鋪底培養(yǎng)皿分離細(xì)胞在培養(yǎng)后3 h出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞獨(dú)有的管樣結(jié)構(gòu) 圖2 HemECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-206 mimics 8 h后各組細(xì)胞內(nèi)miR-206相對(duì)豐度變化 圖3 HemECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-206模擬物后細(xì)胞增殖力變化
Fig 1 Identification of the cells positively selected by CD31 coupled magnetic beads from infantile hemangioma. a. slabstone-like cells start to divide and grow after cultured for 24 hours. b. phagocytic fat function of endothelial cells (red) after isolated cells were cultured withDil-Ac-LDL for 4 hours under fluorescence microscope. c. double expression of CD31 and vWF of cultured cells. d. positive of tubules formed incubation of cultured cells on Matrigel for 3 hours. Fig 2 Changes of miR-206 relative abundance in each group at 8 hours after the miR-206 mimics transfected into HemECs. Fig 3 Changes of proliferation detected after miR-206 mimics transfected into HemECs.

3 討論

miR-206被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子，在胃癌[6]、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的研究中都發(fā)現(xiàn)有miR-206下調(diào)現(xiàn)象[7 ]，這種細(xì)胞內(nèi)miR-206下調(diào)狀態(tài)在肺動(dòng)脈高壓等[8]其他血管性疾病中也有發(fā)現(xiàn)。嬰幼兒血管瘤既有腫瘤的性質(zhì)，同時(shí)又和血管密切相關(guān)，因此，miR-206可能在IH增生期的下調(diào)機(jī)制和腫瘤及血管性疾病中類(lèi)似。提高HeLa細(xì)胞中的miR-206水平，可影響Notch3的表達(dá)，從而增加細(xì)胞凋亡[9]。在Samuel 等的研究中還發(fā)現(xiàn)，減少小鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)miR-206的水平，可引起細(xì)胞增殖能力的提高和凋亡的減少，以及增加細(xì)胞分化表型a-SMA和calponin的表達(dá)，這種作用可以被提高細(xì)胞內(nèi)miR-206的水平所逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明miR-206在細(xì)胞增殖改變、凋亡以及細(xì)胞分化中具有重要的調(diào)節(jié)作用[10]，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，提高細(xì)胞內(nèi)miR-206水平能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，抑制率為(34.2±6.8)%。提高細(xì)胞內(nèi)miR-206水平后，細(xì)胞凋亡比率從對(duì)照組的(1.7±1.6)%提高到(23.9±5.1)%，說(shuō)明miR-206水平變化對(duì)HemECs細(xì)胞的凋亡和增殖都有顯著影響，同時(shí)miR-206對(duì)HemECs細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，部分可能是凋亡在其中發(fā)揮一定的作用，但從凋亡比例改變上看，凋亡細(xì)胞的影響只占據(jù)了一部分。在胃癌和乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-206對(duì)細(xì)胞增殖能力有影響，這種作用是通過(guò)CyclinD2來(lái)影響細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的[11]。結(jié)合這些研究結(jié)果，miR-206可能通過(guò)對(duì)HemECs增殖周期蛋白的影響，調(diào)節(jié)了細(xì)胞的增殖能力改變。在肌肉損傷的修復(fù)[12]以及肌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-206通過(guò)靶向于OTX2，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的作用[13]。在成肌細(xì)胞C2C12的研究中，TGFβ能夠通過(guò)HDAC4影響miR-206的表達(dá)，從而調(diào)控了細(xì)胞的增殖和分化[14]，且miR-206能夠通過(guò)VEGF-A負(fù)向調(diào)控血管生成作用[15]。這些多靶點(diǎn)的作用，提示miR-206可能通過(guò)多個(gè)作用途徑改變HemECs細(xì)胞的功能活性，從而在嬰幼兒血管瘤病程發(fā)展中起到了關(guān)鍵調(diào)控作用。

我們的研究確定了miR-206在嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力改變、凋亡改變以及侵襲能力改變的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。miR-206作為一種和血管疾病相關(guān)的腫瘤抑制因子，在血管瘤病程演化中可能發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，這種作用是通過(guò)對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)控引起的，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制以及對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的這種調(diào)控作用，有待進(jìn)一步地研究。

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Effect of miR-206 up-regulation on proliferation, apoptosis and invasion ability of infantile hemangioma endothelial cells

XUJian-guo,YANGChao,XINGXin,DAIHai-ying,FANGShuo,SUNZhao-sheng.

(DepartmentofPlasticSurgery,FirstAffiliatedHospitalofSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

XINGXin,Email:xingxin57@163.com

Objective To investigate the effect of miR-206 up-regulation on cell proliferation, apoptosis and invasion ability of infantile hemangioma endothelial cells (HemECs). Methods HemECs was isolated from infantile hemangioma digestion tissue by CD31 magnetic bead, then the miR-206 was up-regulated by miR-206 mimics transfection. The apoptosis of HemECs was examined using Annexin V-FITC/PI by flow cytometry and cell proliferation was detected by cck-8 assay method. Invasion ability was determined by Transwell invasion assay. Results The proliferation of HemECs was significantly inhibited after miR-206 mimics transfected into HemECs at 48h, the inhibit rate was (34.2±6.8)%. Concerning transfection within the group of miR-206 mimics compared with the control group, the apoptosis level elevated from (1.7±1.6)% to (23.9±5.1)% after miR-206 mimics transfected into HemECs at 48 h. Matrigel invasion assay demonstrates that, within the group of miR-206 mimics transfection compared with the control group, the number of cells at the opposite surface of Transwell bottom decreased from 30.3±2.4 to 14.3±3.0. Conclusion The miR-206 level in up-regulated HemECs could obviously inhibit cell proliferation ability, elevate the apoptosis level and decrease invasive ability. MiR-206 may have important regulation effect on pathogenesis of infantile hemangioma through adjusting HemECs′ biological activation.

Infantile hemangioma; MiR-206; Endothelial cells； Apoptosis； Cellular invasion

國(guó)家自然科學(xué)基金(81272119)

200433 上海,第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 整形外科

徐建國(guó)(1982-)，男，浙江龍游人，博士.

邢 新，200433，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 整形外科，電子信箱:xingxin57@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.04.016

R732.2

A

1673-7040(2016)04-0238-04

2015-12-24)