文婷婷，利 站，林 程，黃玉韜，關亞靜，胡 晉*

（1.浙江大學 農業(yè)與生物技術學院種子科學中心，浙江 杭州 310058；2.山東省種子管理總站，山東濟南 250100）

油菜種子種皮的結構和細胞壁成分研究

文婷婷1，2，利 站1，林 程1，黃玉韜1，關亞靜1，胡 晉1*

（1.浙江大學 農業(yè)與生物技術學院種子科學中心，浙江 杭州 310058；2.山東省種子管理總站，山東濟南 250100）

為探索油菜種皮的結構和細胞壁成分，借助掃描電鏡和倒置生物顯微鏡對種皮表面和橫斷面結構進行觀察，并采用顯微化學鑒別法和紅外光譜分析法鑒定種皮細胞壁成分。結果表明，油菜種皮表面紋飾為網-穴型，網眼由不規(guī)則的管狀多邊形組成；種皮橫斷面結構由外到內依次為表皮層、柵欄層和糊粉層；靠近種臍處種皮內有白色薄膜，柵欄層和糊粉層結構均逐漸變窄直至消失，種臍處種皮由兩層致密結構組成。油菜品種浙雙3號的種皮細胞壁中含有纖維素、木質素、色素、角質、蛋白質、果膠和脂類等成分。

油菜；種皮結構；細胞壁成分

文獻著錄格式：文婷婷，利站，林程，等.油菜種子種皮的結構和細胞壁成分研究［J］.浙江農業(yè)科學，2016，57（1）：22-25.

油菜是世界四大油料作物之一，在世界油料作物中占有重要地位，也是我國重要的食用油來源和植物蛋白質飼料資源［1］。種皮是種子胚胎與外界環(huán)境間的重要生物屏障，在保護胚胎免受各種生物和非生物逆境危害方面具有重要的意義［2］。此外，種皮在調控胚胎發(fā)育、種子休眠和萌發(fā)、種子品質等方面也起著重要的作用。油菜種皮占全籽的12%～19%，種皮中含有粗蛋白質 18% ～20%，粗脂肪16%，粗纖維31%～34%，菜籽中大部分色素、芥子堿和單寧等抗營養(yǎng)物質也主要存在于種皮中，因此，種皮是影響油菜籽餅粕蛋白質利用價值的重要因素［3］。研究油菜種皮的結構和成分，對種子吸水萌發(fā)、貯藏以及種子處理等具有重要的作用。然而當前對油菜種皮結構和成分的研究尚未見報道，本文應用掃描電鏡和冷凍切片觀察種皮結構，顯微化學鑒別法和紅外光譜分析法鑒定種皮細胞壁成分，以期為油菜種子的萌發(fā)、休眠特性的研究，油菜種質資源貯藏以及油菜籽的綜合利用等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選用油菜種子（浙雙3號）為材料，于4℃冰箱貯藏備用。

1.2 方法

1.2.1 掃描電鏡觀察種皮結構

掃描電鏡觀察種皮結構前的種子預處理參考劉強等［4］的方法，種子用0.1 m o 1·L-1pH值6.9的磷酸緩沖液（PBS）浸泡12 h，接著在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜，倒掉固定液，用0.1 m o 1·L-1P B S漂洗樣品3次，每次15 min。將種皮剝離，橫切種臍，用1%的鋨酸溶液固定樣品1～2 h，倒掉固定液，用0.1 m o 1·L-1P B S漂洗樣品3次，每次 15 min。用 50%，70%，80%，90%，95%的乙醇溶液對樣品依次進行脫水處理，每種濃度處理15 min，再用100%的乙醇處理兩次，每次20 min，接著用乙醇與醋酸異戊酯的混合液（V∶V為1∶1）處理樣品30 min后，用純醋酸異戊酯處理樣品過夜。將樣品進行臨界點干燥，離子濺射鍍膜，掃描式電子顯微鏡（X L 30-E SE M，荷蘭飛利浦公司）觀察，拍照。

1.2.2 冷凍切片觀察種皮色素分布

將油菜干燥種子的種皮剝離下來，利用冰凍切片機（Shandon FE+Shandon Finnesse32，美國 Thermo公司）在-25℃下冰凍切片，厚度7μ m。切片不經染色，直接制成水裝片，于倒置生物顯微鏡（Leica DMIRB，德國Leica公司）下觀察，并用附帶的成像系統(tǒng)拍照。

1.2.3 顯微化學鑒別法鑒定種皮細胞壁成分

顯微化學鑒別法鑒定種皮細胞壁成分參考劉軍等［5］的方法，取種子種皮分別在碘-氯化鋅溶液、鹽酸間苯三酚試劑和蘇丹Ⅳ酒精飽和溶液中染色，觀察種皮橫斷面染色結果。

1.2.4 紅外光譜分析法鑒定種皮細胞壁成分

取種子種皮，液氮研磨成粉末狀，用于紅外光譜掃描觀察。紅外光譜儀（AVATAR370型，美國Thermo Nico1et公司），光譜分辨率4 cm-1，掃描信號累加32次。參照謝晶曦［6］、徐榮等［7］和張曉斌等［8］的分析方法對細胞壁成分進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 油菜種皮表面和橫斷面結構

在掃描電鏡下觀察到，油菜種皮表面紋飾為網-穴型，網眼由不規(guī)則的管狀多邊形組成，網眼的大小和深淺各不相同（圖1中a）。種臍部表面與非種臍部表面紋飾不同，種臍部表面紋理粗糙、不規(guī)整（圖1中b）。種子遇水后，表皮層細胞中的黏質分泌出來，在種皮表面形成透明的黏質層（圖1中c）。

油菜種皮橫斷面可分為三層結構（圖1中d）：最外覆蓋的一薄層為表皮層。表皮層下面是柵欄層，為U形-a（U-shaped-a）狀結構，結構較致密，但有縫隙，該層厚度為25.9～38.5 μ m。第三層為糊粉層，厚度為22.7～27.8 μ m。柵欄層、糊粉層厚度分別約占種皮總厚度的56%和44%。

靠近種臍處，種皮內有白色薄膜（圖1中e）。柵欄層和糊粉層結構均逐漸變窄，直至消失。種臍處由兩層致密結構組成，厚度分別為 37.1～47.5 μ m和 7.6～15.2 μ m，各占種皮總厚度的79%和21%，兩層結構間有一條縫隙。

圖1 油菜種子種皮表面及橫斷面掃描的電鏡照片

2.2 油菜種皮色素分布

不經染色，直接在顯微鏡下觀察冰凍切片，可以清晰地看到油菜種皮的三層橫斷面結構，分別為表皮層、柵欄層以及糊粉層（圖2）。其中，種皮色素即為圖中的棕色帶，主要分布在柵欄層。

2.3 顯微化學鑒別法鑒定種皮細胞壁成分

油菜種皮橫斷面結構經碘-氯化鋅溶液染色呈棕色，鹽酸和間苯三酚反應染成桃紅色，蘇丹Ⅳ酒精飽和溶液染色呈紫紅色。由此可推測油菜種皮細胞壁中含有較多的纖維素、木質素和角質。

2.4 紅外光譜分析法鑒定種皮細胞壁成分

傅立葉變換紅外光譜（FTIR）圖中2 925.33 和2 853.78 cm-1附近是飽和C—H鍵的伸縮振動吸收，主要來自細胞壁中蛋白質、纖維素和果膠等組織成分（圖3）。1 746.19 cm-1為脂類中飽和羧酸酯鍵中羧基C=O的伸縮振動吸收峰。1 651.36 cm-1附近為細胞壁蛋白質上的C=O（酰胺Ⅰ帶）。1 538.61 cm-1附近為蛋白質上N—H特征吸收峰（酰胺Ⅱ帶）。1 056.10 cm-1附近主要為纖維素糖鏈中 C—C和 C—O鍵的吸收峰，1 455.33和1 384.29 cm-1附近為纖維素中甲基的伸縮振動吸收峰。由此可知，油菜種皮中主要含有纖維素、果膠、蛋白質和脂類等成分。

圖2 油菜種子種皮的色素分布

圖3 油菜種皮的紅外光譜

3 小結與討論

3.1 油菜種皮結構

種皮是由珠被發(fā)育而來的套被狀結構，包圍在胚和胚乳之外，是種子的重要組成部分之一，具有保護種胚和促進萌發(fā)時吸收水分的作用［9］。種皮是植物體保守性較強的器官，其形態(tài)性狀和解剖構造在長期的自然進化過程中形成，是受基因控制的穩(wěn)定性狀，受環(huán)境影響較小，因此可以作為分類的重要依據［10］。

不同物種植物的種皮紋飾亞微結構特征存在種的特異性［11］，表明種皮紋飾特征是穩(wěn)定可遺傳的，可用作物種鑒定指標，為分析不同物種的進化及親緣關系提供了可行的方法［12］。有學者認為種皮紋飾由柵欄層高度不平衡或柵欄層外壁突出而引起。本研究發(fā)現(xiàn)，油菜種皮表面紋飾呈現(xiàn)出中央下陷的網-穴狀結構，網眼由不規(guī)則的管狀多邊形組成，可能有利于種子吸水。種子遇水后，表皮層細胞中的黏液分泌出來，迅速擴大、破裂，包圍整個種子表皮細胞的外層細胞壁，有助于種子水化和種子傳播，促進種子在缺水條件下萌發(fā)和形成幼苗。

掃描電鏡和顯微鏡下觀察到油菜種皮結構由表皮層、柵欄層和糊粉層組成，且色素主要分布在柵欄層。柵欄層由外珠被的最內層細胞發(fā)育而來［13］，其致密的結構阻礙種子對水分的吸收。陳玉萍等［14］認為種皮顏色主要由柵欄層決定，并認為柵欄層斑點上的色素可能是由糊粉層上的色素轉移而來。

靠近種臍處，種皮內有白色薄膜，柵欄層和糊粉層結構均逐漸變窄，直至消失。種臍處由兩層致密結構組成，厚度分別為37.1～47.5 μ m和7.6～15.2 μ m，各占種皮總厚度的79%和21%，兩層結構間有一條縫隙。油菜種臍處的特殊結構可能與種子發(fā)育過程中營養(yǎng)物質的運輸和種子萌發(fā)時的水分運輸有關。

3.2 油菜種皮細胞壁成分

種皮合成一系列化合物，在種子抗病蟲害、發(fā)育調控方面起重要作用，也可作為工業(yè)產品的原料，食品與飼料的營養(yǎng)成分。此外，種皮成分對植物的整體質量、價值和產量也產生影響。油菜種皮成分復雜，含有水、蛋白質、糖類、礦物質、纖維素、木質素、色素等［15］。

由顯微化學鑒別法和紅外光譜分析法鑒定表明，本研究油菜品種的種皮細胞壁中含有纖維素、木質素、色素、角質、蛋白質、果膠和脂類等。纖維素是植物細胞壁的主要成分，牢固的纖維素結構使細胞壁具有高強度和抗化學降解的能力［16］。孫群等［17］通過測定硬實種子和非硬實種子種皮粉末中粗纖維含量的差異，認為粗纖維的大量積累增加了種皮的機械強度和不透水性。相關性分析表明：種皮厚度與種皮纖維素含量呈極顯著正相關，與千粒重呈極顯著負相關，即種皮厚，種皮纖維素含量高，千粒重?。?8］。木質素使細胞相連，可增加細胞壁的抗壓強度，強化植物組織，其含量可能與皮殼率成正相關關系，影響著種皮的厚度及堅硬度［19］。此外，木質素可能也是產生油菜種皮顏色的物質之一，具有天然的多酚類結構，是由苯丙烷單元組成的聚合物，含有發(fā)色基及助色基，可與多種物質結合而生成有色物質，也可經氧化生成醌類物質而顯色［20］。有研究表明，種皮木質素含量與油菜的含油量、蛋白質含量等性狀也相關。種皮色素決定油菜籽顏色，同時色素物質也作為信號分子和植物抗菌素參與逆境脅迫、種子休眠等生理過程［21］。Mar1es等［22］研究認為，油菜種皮中的色素組成主要是原花色素，原花色素是一種類黃酮物質，也稱為縮合單寧。角質存在于種皮表皮層，是妨礙水分滲入種內，造成種子硬實的重要原因之一［23］。油菜種子內含有比較豐富的蛋白質，具有負襯質勢，對水分的吸引力很強，因此種子一遇水就會依靠其強大的吸脹作用而迅速吸水［24］。果膠是形成膠質的主要物質，其主要成分是鼠李半乳糖醛酸。果膠作為細胞間的中層起黏合作用，使相鄰的細胞黏合在一起，具有水溶性。

油菜種皮結構和細胞壁成分的研究可為油菜種子萌發(fā)特性的分析和油菜種質資源貯藏提供有利依據，但是各結構及成分對種子吸水萌發(fā)和種子品質產生的不同影響還需進一步研究。

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（責任編輯：張 韻）

S634.3

A

0528-9017（2016）01-0022-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20160109

2015-11-01

浙江省自然科學基金重點項目（Z 3100150）；浙江省科技廳旱糧農業(yè)新品種選育專題（2012C 12902-6-5）

文婷婷（1989-），女，碩士，助理農藝師，主要從事種子科學研究工作，E-mai1：wtt 250100@163.com。

胡 晉，男，教授，博士生導師，從事種子科學研究工作，E-mai1：jhu@zju.edu.cn。