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纖維蛋白膠應(yīng)用于犬自體網(wǎng)狀皮片移植效果的觀察

2016-08-10 08:04亢心陳智華郭慧琳范希萍高宇航年聚盆韓鵬
關(guān)鍵詞:網(wǎng)孔皮片網(wǎng)狀

亢心,陳智華*,郭慧琳,范希萍,高宇航,年聚盆,韓鵬

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心,甘肅 蘭州 730046)

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纖維蛋白膠應(yīng)用于犬自體網(wǎng)狀皮片移植效果的觀察

亢心1,陳智華1*,郭慧琳2,范希萍1,高宇航1,年聚盆1,韓鵬1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心,甘肅 蘭州 730046)

為探究纖維蛋白膠(fibrin glue,F(xiàn)G)應(yīng)用于犬自體網(wǎng)狀皮片移植術(shù)中的效果,選取15只犬作為試驗動物,于兩前肢建立3 cm×4 cm的全層皮膚缺損模型,以胸背部作為供皮區(qū),將纖維蛋白膠應(yīng)用于網(wǎng)狀皮片移植術(shù)中,以單純網(wǎng)狀皮片移植為對照,于術(shù)后第3、5、7、14、28天隨機(jī)選取3只進(jìn)行大體觀察和移植皮片局部觀察,并制備石蠟切片進(jìn)行組織學(xué)觀察。皮片局部觀察結(jié)果顯示,試驗組紅腫、滲出較對照組輕微,炎性反應(yīng)期短;術(shù)后28 d,所有皮片生長良好,試驗組線性瘢痕較對照組輕。組織學(xué)觀察結(jié)果顯示,試驗組較對照組炎性細(xì)胞的浸潤期短,膠原纖維排列規(guī)則,皮膚附屬結(jié)構(gòu)完整。結(jié)果表明,纖維蛋白膠可縮短創(chuàng)面炎性反應(yīng)期,增強(qiáng)局部組織修復(fù)能力,減少瘢痕的過度增生,可使成活后的移植皮片結(jié)構(gòu)和功能更接近正常皮膚。

犬;纖維蛋白膠;網(wǎng)狀皮片;皮膚移植

投稿網(wǎng)址:http://xb.ijournal.cn

纖維蛋白膠(fibrin glue, FG)是一種以纖維蛋白原、ⅩⅢ因子、抑肽酶、凝血酶和鈣離子為主要成分的生物粘合劑。FG具有良好的生物相容性和可降解性[1],可促進(jìn)血管的生長、形成和組織損傷的修復(fù)[2],并參與體內(nèi)一系列的病理生理過程。近年來,F(xiàn)G已被應(yīng)用于普通外科、胃腸外科、神經(jīng)外科和美容外科等,并取得了良好的臨床效果。筆者將FG應(yīng)用于犬自體網(wǎng)狀皮片移植術(shù)中,以單純自體網(wǎng)狀皮片移植為對照,觀察移植皮片的生長狀態(tài),通過HE.染色和Masson 3色法觀察移植部位局部組織的修復(fù)情況,以評估FG應(yīng)用于犬自體網(wǎng)狀皮片移植術(shù)中的臨床效果。

1 材料與方法

1.1試驗動物

試驗動物為健康成年雜種犬 15條,雌雄不拘,體質(zhì)量15~20 kg,均購自蘭州市畜禽交易市場。常規(guī)疫苗免疫,試驗前安靜單籠飼養(yǎng)1周,飼喂全價犬糧,自由飲水。

1.2主要試劑與儀器

主要試劑:豬源纖維蛋白原粉為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院臨床試驗室采用反復(fù)冷沉淀法[3]提取(纖維蛋白原純度(%)為纖維蛋白原濃度與總蛋白濃度的比,純度>85%);500 IU/mL凝血酶原為廣州白云山醫(yī)用膠公司產(chǎn)品;4 500 KIU/mg抑肽酶來自Amresco;氯化鈣為天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;0.9%氯化鈉為四川科倫藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品;陸眠寧Ⅱ為吉林省華牧動物保健品有限公司產(chǎn)品;多聚甲醛為天津市元力化工有限公司產(chǎn)品。

主要儀器:Leica切片機(jī)(德國萊卡公司);OlympusDP–71顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司);HD–P攤片機(jī);HD–H烘片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);DH3600恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯,特儀器有限公司);ZHJH–1112C超凈工作臺(深圳市華弘特凈化技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1FG的配置

于術(shù)前15 min在無菌操作臺內(nèi)制備FG前體物質(zhì)A液和B液。A液配置方法:將180 mg纖維蛋白原和2 mL滅菌注射用水混合,置于37 ℃水浴鍋中輕搖,使纖維蛋白原完全溶解;B液配置方法:將1 000 IU凝血酶原和2 mL 40 mmol/mL氯化鈣溶液混合,置于室溫下輕搖,使其完全溶解。用雙聯(lián)注射器的2個針筒各吸取1 mL,固定于雙聯(lián)注射器支架內(nèi)待用。

1.3.2手術(shù)方法

前肢皮膚缺損模型的建立:術(shù)前禁食12 h,禁水6 h。術(shù)前按體質(zhì)量0.06 mL/kg肌肉注射陸眠寧Ⅱ,進(jìn)入平穩(wěn)麻醉狀態(tài)后,俯臥保定。術(shù)部選擇在兩前肢橈骨正面近端皮膚較平坦區(qū)域,常規(guī)備皮,避開前肢主要血管,切除3 cm×4 cm范圍的全厚皮片,清除創(chuàng)面內(nèi)皮下組織至深筋膜,徹底止血,完成犬前肢皮膚缺損模型的建立。

供皮區(qū)的選擇及網(wǎng)狀皮片的制備:俯臥保定,選擇胸背部皮源充足、毛發(fā)旺盛區(qū)域作為供皮區(qū)。常規(guī)備皮,并用手法取皮制備皮片,在胸背部正中線左側(cè)或右側(cè)切取3 cm×4 cm的全厚皮片,用溫生理鹽水沖洗后平均分為2片,每片1.5 cm×4 cm,固定于無菌木板上,平行于全厚皮片的長軸切制4排網(wǎng)孔,排間距為5 mm,每排含5個7 mm網(wǎng)孔,制備成網(wǎng)狀皮片,備用。

網(wǎng)狀皮片的移植:將配置好的A液和B液用雙聯(lián)注射器均勻涂布于犬右前肢(試驗組)皮膚缺損部位,將制備好的網(wǎng)狀皮片真皮層貼合于涂膠創(chuàng)面放置,調(diào)整皮片,使其被毛方向與該區(qū)域周圍健康皮膚被毛方向一致,手指按壓固定 1 min,采用 3–0腸線行皮片與受皮區(qū)創(chuàng)緣的結(jié)節(jié)縫合,調(diào)整縫線,使創(chuàng)緣對合良好,結(jié)節(jié)縫合針距約8 mm。對照組以同樣的縫合方法進(jìn)行左前肢單純網(wǎng)狀皮片移植。全部皮膚移植術(shù)由同一術(shù)者完成。

1.3.3術(shù)后護(hù)理及觀察

采用自制凡士林紗布包扎移植區(qū)域,并涂抹適量紅霉素軟膏預(yù)防局部感染。采用彈性繃帶和自粘彈性繃帶雙層加壓包扎。術(shù)后單籠安靜飼養(yǎng),全程佩戴伊麗莎白圈。6 h后恢復(fù)自由飲水,12 h后恢復(fù)正常飼喂。全身抗感染治療(按體質(zhì)量每1 kg 20萬單位肌肉注射青霉素,每天2次)。定期更換包扎的敷料和藥物。

術(shù)后第3、5、7、14、28 天,觀察犬的飲食、大小便、運動和疼痛反應(yīng)。觀察移植皮片外觀并進(jìn)行淺表觸診,記錄移植皮片的顏色、質(zhì)地、腫脹程度、滲出及滲出物性質(zhì)。術(shù)后第100天觀察移植區(qū)域被毛生長情況。

1.3.4切片制作與觀察

于術(shù)后第3、5、7、14、28天隨機(jī)選取3只犬,將其全身麻醉后俯臥保定,采集移植區(qū)域橈骨近端0.5 cm×2.5 cm的全層皮片組織。用4 %多聚甲醛固定,制作石蠟切片,采用 HE.染色,于光鏡下 40倍觀察皮膚附屬器官的發(fā)育,100倍觀察炎性浸潤范圍與肉芽生長情況,400倍觀察成纖維細(xì)胞數(shù)量與排列。Masson 3色法染色切片,觀察膠原的排列與數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1犬的飲食、大小便、運動和疼痛反應(yīng)情況

試驗動物在術(shù)后全部存活,飲食、大小便及運動均正常。術(shù)后第3天,試驗組和對照組均表現(xiàn)出較強(qiáng)烈的疼痛反應(yīng),第5天疼痛反應(yīng)減輕,第7天所有犬疼痛反應(yīng)微弱,第14天和第28天疼痛反應(yīng)消失,精神狀態(tài)良好。

2.2移植皮片的局部觀察結(jié)果

術(shù)后第3天,2組皮片均呈白色,質(zhì)地柔軟,輕微水腫,試驗組移植表面局部有少量血性滲出,移植皮片中央網(wǎng)孔創(chuàng)圍呈紅色,對照組的滲出較試驗組的多,紅色創(chuàng)圍的面積較試驗組的大;第5天,網(wǎng)孔創(chuàng)緣仍水腫,創(chuàng)圍呈紅色,但試驗組創(chuàng)緣收縮明顯,滲出減少,對照組血性滲出未見減少;第 7天,2組皮片局部紅腫減輕,與受皮區(qū)創(chuàng)緣結(jié)合較為緊密,與對照組相比,試驗組皮片網(wǎng)孔明顯縮小,未見滲出,肉芽組織飽滿、鮮嫩;第14天,試驗組皮片質(zhì)地柔軟,肉芽組織基本與創(chuàng)緣持平,且大部分被上皮覆蓋,僅有少許殘留創(chuàng)面,對照組皮片顏色較試驗組蒼白,網(wǎng)孔未被完全填充;第28天,2組移植皮片生長良好,質(zhì)地柔軟有彈性,試驗組皮片網(wǎng)孔收縮后呈細(xì)線形瘢痕(圖1–A),對照組網(wǎng)孔收縮不規(guī)則,瘢痕明顯(圖1–B);第100天,試驗組被毛較對照組濃密(圖1–C),與供皮區(qū)被毛外觀相似(圖1–D)。

圖1 移植創(chuàng)面的局部觀察結(jié)果Fig.1 Part observation in the transplant area

2.3移植創(chuàng)面的組織學(xué)觀察結(jié)果

術(shù)后第3天,100倍鏡下可見試驗組皮片充血程度、真皮下毛細(xì)血管擴(kuò)張程度及炎性細(xì)胞浸潤范圍均小于對照組,炎性細(xì)胞浸潤區(qū)域有新生毛細(xì)血管芽,對照組未見;第5天,與對照組相比,試驗組肉芽組織、新生毛細(xì)血管和新生毛囊較多,炎性細(xì)胞浸潤范圍??;第7天,2組皮片的真皮層均可見新生毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞大量浸潤和膠原增生,與對照組相比,400倍鏡下可見試驗組表皮細(xì)胞層數(shù)增加,顆粒層細(xì)胞明顯增多,真皮層成纖維細(xì)胞排列規(guī)則,炎性細(xì)胞較少(圖2–A、B);第14天,100倍鏡下對照組上皮細(xì)胞增生少,成纖維細(xì)胞和新生膠原纖維排列不規(guī)則,真皮層有少量炎性細(xì)胞,而試驗組新生膠原纖維排列規(guī)則,毛囊周圍有膠原纖維環(huán)繞,真皮各層結(jié)構(gòu)清晰,未見炎性細(xì)胞(圖2–C、D);第28天,與試驗組相比,對照組表皮進(jìn)一步增生變厚,有明顯毛囊新生,肉芽組織大量生成,膠原纖維增粗,排列不規(guī)則, 40倍鏡下試驗組皮膚結(jié)構(gòu)清晰,各層界限明顯,毛囊結(jié)構(gòu)完整,膠原纖維緊密包圍毛囊,排列整齊(圖2–E、F、G、H)。

圖2 移植創(chuàng)面的組織學(xué)觀察結(jié)果Fig.2 Histopathological observation in the transplant area

3 結(jié)論與討論

網(wǎng)狀皮片移植術(shù)有效解決了皮源匱乏問題,可用于治療犬四肢皮膚缺損。傳統(tǒng)的網(wǎng)狀植皮加壓打包方法難以使移植皮片與受皮創(chuàng)面完全緊密貼服,在肢體活動時可能導(dǎo)致移植皮片移位,不能完全去除死腔,且受皮創(chuàng)面范圍較大,受皮區(qū)皮下脂肪較多時血管稀少,與皮片建立脈管連接較困難。有研究表明,移植皮片在術(shù)后第7天內(nèi)必須形成穩(wěn)定的脈管系統(tǒng),否則皮片會死亡[4]。為保證網(wǎng)狀皮片在移植后盡快建立血運,需將受皮區(qū)過多的皮下組織去除,但上述操作常常增大了皮片與受皮區(qū)的間隙,導(dǎo)致皮片成活困難。本試驗中采用FG配合網(wǎng)狀皮片移植術(shù),利用FG可填補(bǔ)缺損、粘合的特點,填充了皮片與受皮區(qū)的間隙,使皮片在受體床上的貼合更加穩(wěn)固。網(wǎng)狀皮片是在全厚皮片的基礎(chǔ)上,用器械做數(shù)個網(wǎng)孔制備而成,每個網(wǎng)孔雖可作為一個獨立的引流系統(tǒng),在一定程度上排出滲出液和積液,但同時每個網(wǎng)孔又成為一個獨立的創(chuàng)傷,不能有效隔絕細(xì)菌的侵入和滋生,從而使網(wǎng)狀皮片移植術(shù)中的感染率增高。試驗組采用FG涂布創(chuàng)面,在完成網(wǎng)狀皮片移植后短時間內(nèi)封閉網(wǎng)孔,減少了細(xì)菌的入侵,降低了術(shù)后感染的風(fēng)險。本試驗中受皮區(qū)為前肢橈骨正面近端。該處皮下血管豐富,按壓止血較為困難,用止血鉗鉗夾與結(jié)扎易造成組織挫滅增多,使炎性清除期延長,加重術(shù)后滲出,而FG良好的止血效果可減少術(shù)后皮片下血腫、血清腫的發(fā)生[5]??梢姡囼灲M比對照組滲出較少且持續(xù)時間較短的主要原因是FG填充了皮片與受皮區(qū)間的死腔,使皮片在穩(wěn)固貼合的同時完成了創(chuàng)面止血[6],為血管的新生與炎性清除創(chuàng)造了良好的環(huán)境。

創(chuàng)傷愈合早期,F(xiàn)G中的纖維蛋白可作為細(xì)胞遷移的支架與組織修復(fù)的介質(zhì)[7],刺激成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞向創(chuàng)傷部位移動、粘附和增殖[8–9],促進(jìn)其吞噬變性膠原和其他碎片[10];另外,纖維蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可網(wǎng)羅細(xì)胞因子,提高局部細(xì)胞因子濃度,加強(qiáng)細(xì)胞因子對靶細(xì)胞的作用,因此,與對照組相比,試驗組的炎性反應(yīng)程度低,炎性反應(yīng)時間短。新生毛細(xì)血管數(shù)量和成纖維細(xì)胞較多的原因可能與此相關(guān)。毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞作為肉芽組織的主要成分,可以填充組織缺損部位,增強(qiáng)創(chuàng)面抗感染的能力,在發(fā)生收縮后有利于創(chuàng)面的愈合,并為再上皮化創(chuàng)造條件,加速組織愈合進(jìn)程[11–12]。肉芽組織是膠原沉積和改建的場所,而成纖維細(xì)胞是早期創(chuàng)傷修復(fù)過程中肉芽組織的主要功能細(xì)胞。較長的炎性反應(yīng)期中各種炎性細(xì)胞因子刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生過量的膠原是瘢痕過度增生的原因之一[13];成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面上皮化后受堿性成纖維細(xì)胞因子的刺激繼續(xù)旺盛增殖,合成各種構(gòu)成瘢痕組織的細(xì)胞外基質(zhì)。有研究表明,F(xiàn)G應(yīng)用14 d后,愈合進(jìn)入再塑形期,堿性成纖維細(xì)胞生長因子回落到低濃度[14]。本試驗中,F(xiàn)G的使用縮短了炎性反應(yīng)期,且在創(chuàng)面上未引起瘢痕組織過度增生,因此,試驗組在應(yīng)用FG 14 d后,肉芽組織中的膠原纖維較對照組的細(xì),且排列更規(guī)則,皮片移植區(qū)各層的結(jié)構(gòu)與功能較完整。

綜合分析結(jié)果表明,F(xiàn)G可縮短炎性清除期并加快新生血管形成,有利于肉芽組織上皮化和細(xì)胞外基質(zhì)的整合,加快移植皮片創(chuàng)面修復(fù)和改建進(jìn)程,促進(jìn)移植皮片愈合,減少瘢痕組織過度增生,能使成活后的移植皮片結(jié)構(gòu)和功能更接近正常皮膚。

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責(zé)任編輯:王賽群

英文編輯:王 庫

Observation the transplant effects of glue fibrin on dog mesh skin graft surgery

Kang Xin1, Chen Zhihua1*, Guo Huilin2, Fan Xiping1, Gao Yuhang1, Nian Jupen1, Han Peng1
(College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2.Gansu Provincial Center for Animal Disease Control and Prevention, Lanzhou 730046, China)

In order to investigate the effects of glue fibrin (FG) on the transplantation of autologous mesh skin graft in dogs, 15 dogs as experimental animal were selected to set up a model of whole layer skin defection with 3 cm×4 cm at their two forelimbs. The chest and back were selected as donor area; By adopting the usage of FG in dog mesh skin graft surgery as test group and the single mesh skin graft surgery as control, three dogs were randomly selected for whole and part observation in skin graft at the 3rd, the 5th, the 7th, the 14thand the 28thday, the paraffin sections were made for histological observation as well. The part observation result showed that swelling and exudation in the test group was lighter than that in the control, inflammatory reaction period was shorter in the test group; after surgery of 28 days, all skin grafts grew well, and linear scar in the test group was less than that in the control. The result from histopathology observation showed that the time of inflammatory cell infiltration was short; the collagen fibers arranged regularly; and skin appendages was complete in the test group. The results showed that FG could shorten the inflammatory response period, enhance the ability of local tissue repair and reduce scar hyperplasia, which made the structure and function of survival skin grafts closer to the normal skin.

dog; fibrin glue; mesh skin graft; dermatoplasty

亢心(1989—),女,甘肅平?jīng)鍪校T士研究生,主要從事小動物疾病診療技術(shù)研究,vetkang@126.com;*通信作者,郭慧琳,教授,主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究,13609320234@126.com

S857.13+2

A

1007-1032(2016)04-0415-04

2015–12–01 修回日期:2016–06–16

甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)專項(GNSW–2011–26)

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