王 玉 綜述，胡 兵 審校

上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學科，上海超聲醫(yī)學研究所，上海 200233

專家述評

低頻超聲對前列腺細胞及組織作用的研究進展

王 玉 綜述，胡 兵 審校

上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學科，上海超聲醫(yī)學研究所，上海 200233

胡兵，教授，主任醫(yī)師，博士生導師。上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學科主任，上海超聲醫(yī)學研究所所長，上海交通大學醫(yī)學影像學所副所長。1983年畢業(yè)于浙江大學醫(yī)學院醫(yī)療系本科，1990年畢業(yè)于上海交通大學醫(yī)學院生物醫(yī)學工程系，師從周永昌教授。

現(xiàn)任中華醫(yī)學會超聲專業(yè)委員會副主任委員，中國超聲醫(yī)學工程學會副會長，上海市聲學學會副理事長兼醫(yī)學超聲專業(yè)委員會主任委員，中國醫(yī)師學會超聲分會副會長。享受政府特殊津貼。先后獲上海市優(yōu)秀科技啟明星、銀蛇獎、全國衛(wèi)生系統(tǒng)先進工作者稱號。入選國家人事部“百千萬人才工程”優(yōu)秀學科帶頭人重點培養(yǎng)計劃。長期從事臨床超聲的診斷和研究工作。目前致力于高強度聚焦超聲（HIFU）腫瘤治療研究、腎腫瘤、前列腺癌微創(chuàng)介入治療研究以及女性盆底功能障礙疾病三維超聲的研究。承擔國家自然科學基金項目、部及市級課題多項。作為第一完成人獲市部級科委科技進步獎二等獎二次，三等獎五次。

目前臨床上治療前列腺疾病的方法很多，但均存在一定的局限性，開發(fā)有效的微創(chuàng)療法成為一項重要任務。近年來，隨著超聲技術的不斷發(fā)展和改進，低頻超聲在前列腺疾病治療中作用的研究越來越深入，低頻超聲不僅能誘導人前列腺癌細胞的凋亡及自噬、抑制癌細胞的侵襲轉移，還可增加細胞膜的通透性，從而對前列腺增生組織和前列腺癌組織產(chǎn)生各種生物學效應。本文就這一領域的研究進展進行綜述。

低頻超聲；前列腺疾病；生物效應；超聲微泡

前列腺炎、前列腺增生、前列腺癌是危害男性健康和生活質量的常見疾病［1］。目前，臨床治療前列腺疾病的方法雖然很多，但由于藥物的不良反應、血-前列腺屏障的存在及手術的創(chuàng)傷性等，均存在一定的局限性。因此，積極開發(fā)有效的微創(chuàng)療法是目前面臨的一項重要任務。低頻超聲通常指頻率范圍在20 kHz～1 MHz 的超聲波。波長較長、聲能吸收少、組織穿透力強及對正常組織損傷較小等是其特點［2］。其生物學效應包括機械效應、空化效應、熱效應及化學效應等［3］。近年來，隨著超聲技術的不斷發(fā)展和改進，研究低頻超聲在前列腺疾病治療中的作用越來越深入，本文就這一領域的研究進展進行綜述。

1 低頻超聲能誘導人前列腺癌細胞凋亡

陳旖旎等［4］采用頻率為21 kHz、輻照時間為2 min、占空比為30%的超聲聯(lián)合微泡對前列腺癌細胞進行輻照，結果發(fā)現(xiàn)前列腺癌DU145細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。林艷端等［5］通過對兩種常見的人前列腺癌細胞DU145和PC3細胞進行研究，發(fā)現(xiàn)低頻低功率超聲聯(lián)合微泡造影劑可明顯誘導兩種細胞發(fā)生早期凋亡，且對PC3細胞早期凋亡率的影響強于DU145細胞，這一結果有助于更系統(tǒng)地評估低頻低功率超聲聯(lián)合微泡對不同時期前列腺癌的療效。Bai等［6］進一步利用低頻超聲聯(lián)合微泡輻照人前列腺癌PC3細胞后發(fā)現(xiàn)，單獨超聲治療組和超聲聯(lián)合微泡治療組的Bcl-2 mRNA及蛋白表達均較對照組減少，Bax mRNA及蛋白表達均較對照組增高，且以超聲聯(lián)合微泡組最明顯，證實低頻超聲聯(lián)合微泡能誘導人前列腺癌細胞凋亡，其機制可能是通過上調Bax及下調Bcl-2表達來實現(xiàn)（表1～2）。Xu等［7］的研究表明，低頻超聲可誘導人前列腺癌DU145細胞凋亡，其機制可能是通過下調小凹蛋白1（caveolin-1）和磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）的表達來實現(xiàn)。以上研究表明，低頻超聲能誘導人前列腺癌細胞凋亡，為治療前列腺癌提供了一種新的策略。

表 1 各組細胞輻照24 h后細胞凋亡率(±s）

表 1 各組細胞輻照24 h后細胞凋亡率(±s）

#：與對照組比較，P＜0.05；*：與單獨超聲組比較，P＜0.05

組別　　凋亡率（%）對照組　2.56±0.22單獨超聲組　 5.40±0.25#超聲聯(lián)合微泡組　 12.77±0.31#*

表 2 輻照后24 h各組細胞Bcl-2和Bax mRNA相對表達量（±s）

表 2 輻照后24 h各組細胞Bcl-2和Bax mRNA相對表達量（±s）

#：與對照組比較，P＜0.05；*：與單獨超聲組比較，P＜0.05

組別　Bcl-2 mRNA 　Bax mRNA對照組　97.12±25.97　8.63±0.87單獨超聲組　21.17±3.39#　28.00±7.00#超聲聯(lián)合為微泡組　 4.75±2.11#*　140.30±26.02#*

2 低頻超聲能誘導人前列腺癌細胞自噬

林艷端等［8］使用低頻超聲聯(lián)合微泡輻照人雄激素非依賴性前列腺癌PC3及DU145 細胞，發(fā)現(xiàn)低頻超聲聯(lián)合微泡造影劑能明顯誘導這兩種細胞自噬，且對兩者的作用無選擇性（圖1）。陳旖旎等［4］采用透射電鏡觀察頻率為21 kHz的低頻超聲聯(lián)合微泡對前列腺癌DU145細胞及正常前列腺上皮RWPE-1細胞的生物學作用，輻照2 min，占空比30%，結果發(fā)現(xiàn)對照組的兩種細胞未出現(xiàn)自噬現(xiàn)象，而超聲聯(lián)合微泡組兩種細胞均出現(xiàn)自噬。Wang等［9］的研究表明，低頻超聲聯(lián)合微泡造影劑可上調人前列腺癌DU145細胞的自噬相關基因Beclin-1表達，導致自噬。以上研究表明，低頻超聲能誘導人前列腺癌細胞自噬，為低頻超聲對前列腺癌細胞作用機制的研究提供了新的方向。

圖1 PC3細胞及DU145細胞經(jīng)吖啶橙染色后熒光顯微鏡下所見的酸性囊泡及正常細胞

3 低頻超聲能抑制人前列腺癌細胞侵襲轉移

Wang等［10］的研究表明，低頻超聲聯(lián)合微泡可降低人前列腺癌DUl45細胞的侵襲轉移能力。白文坤等［11］的研究表明，低頻低能量超聲聯(lián)合微泡可抑制人前列腺癌PC3細胞的侵襲。Wei等［12］的研究表明，低頻低能量超聲聯(lián)合微泡可抑制人前列腺癌細胞的轉移，其機制可能是通過下調基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）和MMP-9蛋白表達來實現(xiàn)（圖2）。林艷端等［13］使用頻率為1 MHz的超聲聯(lián)合微泡輻照人前列腺癌PC3、DUl45細胞，并探索其對前列腺癌細胞凋亡、侵襲能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)低頻超聲聯(lián)合微泡可促進脂質體介導的Rac1-shRNA質粒轉染兩種人雄激素非依賴性前列腺癌細胞，最終通過抑制PC3、DU145細胞中Racl蛋白表達而促進細胞早期凋亡，同時可抑制其侵襲能力。

圖 2 低頻低能量超聲聯(lián)合微泡下調MMP-2和MMP-9蛋白表達

4 低頻超聲能增加細胞膜的通透性

Zhang等［14］使用低頻超聲輻照人前列腺癌DU145細胞，分別在即刻及6h后觀察，結果發(fā)現(xiàn)低頻超聲聯(lián)合微泡產(chǎn)生的聲孔效應可影響不同時間點細胞的形態(tài)、細胞攝取鈣黃綠素水平及細胞活性。Bai等［15］使用頻率為21 kHz、聲強為4.6 mW/cm2的低頻超聲聯(lián)合微泡造影劑輻照人前列腺癌PC3細胞，發(fā)現(xiàn)低頻超聲聯(lián)合微泡可促進增強型綠色熒光蛋白 （enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因進入PC3細胞，而低頻超聲聯(lián)合微泡組較對照組EGFP表達明顯增加（圖3）。Tata等［16］使用頻率為932.7 kHz的超聲輻照人前列腺癌細胞LnCap，結果表明其產(chǎn)生的空化效應可增加載入GFP基因的質粒轉入此種細胞，轉化率達65%。林艷端等［17］的研究表明，使用低頻超聲聯(lián)合微泡造影劑可促進脂質體介導的野生型p53質粒轉染人雄激素非依賴性前列腺癌DUl45細胞，明顯提高其早期凋亡率，機制可能與上調p53蛋白、下調MDM2蛋白表達有關。Duvshani-Eshet等［18］應用頻率為1 MHz的超聲聯(lián)合微泡介導pPEX基因轉染，結果發(fā)現(xiàn)前列腺癌細胞的增殖、轉移受到抑制，細胞凋亡增加，同時周圍組織未受損傷。以上研究表明，超聲聯(lián)合微泡是一種新型非病毒轉染的安全有效的基因治療方法。Wang等［10］的研究表明，低頻超聲聯(lián)合微泡治療后24 h，單獨超聲組、單獨鹽酸米托蒽醌組及超聲聯(lián)合微泡+鹽酸米托蒽醌組細胞增殖均受到抑制，以單獨鹽酸米托蒽醌組及超聲聯(lián)合微泡+鹽酸米托蒽醌組最明顯，其機制主要是通過增加細胞膜的通透性實現(xiàn)的。張蔚等［19］使用不同頻率低頻超聲聯(lián)合微泡促進脂質體介導的pEGFP質粒轉染人前列腺癌PC3細胞，結果發(fā)現(xiàn)在相同的聲強、相同的輻照面積下，隨著超聲頻率升高，轉染率呈下降趨勢。Watanabe等［20］采用1 MHz、1.0 W/cm2、10%的占空比、輻照時間 60 s的超聲照射3種超聲微泡造影劑（Levovist、YM454、MRX-815H）以促進pBKCMV-luc質粒轉染前列腺癌PC3細胞，結果發(fā)現(xiàn)在同等細胞存活率的情況下，不同超聲微泡造影劑的轉染率不同（YM454＞MRX-815H＞Levovist），同時發(fā)現(xiàn)含脂質體外殼的微泡轉染率明顯高于無脂質體外殼的微泡。以上研究表明，低頻超聲聯(lián)合微泡造影劑能增加細胞膜的通透性，且進一步促進細胞內化療藥物的遞送、基因的轉染，從而提高療效。

圖 3 低頻超聲聯(lián)合微泡促進脂質體介導的EGFP基因轉染

5 低頻超聲對前列腺增生組織的作用

張唯力等［21］采用UGT 1025型超聲基因轉染儀，以頻率1 MHz、聲強0.5 W/cm2在體外對大鼠前列腺進行照射，結果顯示超聲輻照白蛋白微泡可增加良性前列腺增生大鼠的前列腺組織通透性。魏武然等［22］采用l MHz低頻超聲輻照慢性前列腺炎大鼠，發(fā)現(xiàn)低頻超聲聯(lián)合微泡造影劑不僅可將藥物靶向輸送至病變部位，還能增加血-前列腺屏障的通透性，從而達到治療前列腺疾病的目的。金龍等［23］采用頻率831 kHz、峰值負壓4.3 MPa、平均聲強0.55 W/cm2的脈沖式非聚焦超聲聯(lián)合凝血酶原作用于前列腺，結果證實超聲空化聯(lián)合凝血酶原在一定程度上可阻斷犬前列腺血流灌注，其可能機制是損傷破壞前列腺內的血管，造成血栓及血腫。戴君勇等［24］使用頻率1 MHz、聲強0.5 W/cm2的超聲對大鼠增生前列腺進行照射，結果顯示低頻超聲聯(lián)合白蛋白微泡造影劑可增加抗雌激素藥物4-羥基他莫昔芬（OHT）對大鼠前列腺增生的治療作用，其機制可能是降低Bcl-2表達。Yang等［25］的研究表明，低頻超聲聯(lián)合微泡能誘導犬良性前列腺增生組織的細胞凋亡，且可降低血前列腺特異性抗原（prostatespecific antigen，PSA）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）表達（表3）。Lake等［26］用頻率為750 kHz的低頻超聲進行實驗，結果發(fā)現(xiàn)低頻超聲造成的組織毀損術能準確破壞前列腺組織，并起即時尿道減壓的作用。

表 3 低頻超聲聯(lián)合微泡降低PSA、iNOS和SOD表達

6 低頻超聲對前列腺癌組織的作用

Liu等［27］使用頻率為831 kHz的低頻超聲對兔前列腺癌進行輻照，結果表明低頻超聲可打開血-前列腺癌屏障。南淑良等［28］使用80 kHz的低頻超聲輻照裸鼠人前列腺癌皮下移植瘤，輻照前在瘤體內注射EGFP質粒，3 d后用激光共聚焦顯微鏡觀察并分析EGFP的平均熒光強度，同時進行病理學檢查。結果發(fā)現(xiàn)，超聲輻照組EGFP表達明顯強于單純裸質粒注射組，且EGFP的表達主要集中于細胞質；病理學檢查表明低頻超聲輻照后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞膜上形成空泡并有核碎裂等改變。Yang等［29］使用480 kHz 的射頻消融儀聯(lián)合頻率20 kHz、聲強1 W/cm2、占空比40%、微泡體積0.20 mL、輻照時間為3 min的低頻超聲治療裸鼠前列腺癌皮下移植瘤，結果表明超聲血管損毀術后，腫瘤組織血供恢復的主要原因可能是瘤組織微血管內血栓溶解；超聲血管損毀術不僅能增大射頻消融灶體積，還能促進射頻消融術后殘余灶的細胞凋亡及抑制殘余灶的細胞增殖。Shen等［30］的研究則表明，低頻超聲聯(lián)合微泡輻照人前列腺癌皮下移植瘤后，可將其血管損毀，延緩腫瘤生長，機制可能是通過降低環(huán)氧化酶-2 （cyclooxygenase 2，COX-2）及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達來實現(xiàn)（圖4）。

圖 4 低頻超聲聯(lián)合微泡降低COX-2和VEGF表達

綜上所述，低頻超聲通過作用于前列腺細胞和組織，誘導人前列腺癌細胞凋亡、自噬，并抑制癌細胞侵襲轉移，從而增加細胞膜及組織的通透性，打開血管內皮細胞間的緊密連接，增加血-前列腺屏障的通透性，促進藥物或基因進入前列腺細胞及組織內，發(fā)揮治療效果。此外，破壞前列腺組織微循環(huán)，形成局部毛細血管血栓，最終導致前列腺局部組織壞死或萎縮，從而使前列腺疾病得到治療或緩解。

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Progress on effects of low-frequency ultrasound on prostatic tissues and cells

WANG Yu， HU Bing
（Department of Ultrasound in Medicine， Shanghai Sixth People's Hospital， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai Institute of Ultrasound in Medicine， Shanghai 200223， China）

Correspondence to： HU Bing E-mail： binghu_stephen@163.com

There are many prostate disease treatments in clinic， but some limitations still exist. Developing an effective and minimally invasive treatment is an important task. In recent years， with the continuous development and the improvement of ultrasonic technology， the study of low-frequency ultrasound in the treatment of prostate disease is going deeply. Low-frequency ultrasound can not only induce apoptosis and autophagy and inhibit metastasis of prostate cancer cells， but also increase the permeability of cell membrane， resulting in biological effects on prostatic hyperplasia and prostate cancer tissues. The present paper summarizes the research progress in this field.

Low-frequency ultrasound； Prostate disease； Biological effect； Ultrasound microbubble

R445.1

A

1008-617X（2016）02-0093-06

國家自然科學基金（No： 81271597）

胡兵 E-mail：binghu_stephen@163.com

2016-06-03）