宋及時，馬珊珊#，孟　楠，王欣欣，姚　寧，朱相展，程　康，楊　波，關(guān)方霞1,#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450001　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450052　3)中美(河南)荷美爾腫瘤研究院 鄭州 450000

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rhMG53蛋白聯(lián)合hUC-MSCs移植對阿爾茨海默鼠的治療作用*

宋及時1)，馬珊珊1)#，孟楠2)，王欣欣2)，姚寧3)，朱相展3)，程康1)，楊波2)，關(guān)方霞1,2)#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細(xì)胞研究室 鄭州 4500012)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州 4500523)中美(河南)荷美爾腫瘤研究院 鄭州 450000

摘要目的：研究rhMG53蛋白聯(lián)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)移植對阿爾茨海默模型鼠(APP轉(zhuǎn)基因小鼠)的治療作用。方法：40只APP+小鼠隨機(jī)分為APP+組、hUC-MSCs組、rhMG53組和rhMG53聯(lián)合hUC-MSCs組(聯(lián)合組)，分組處理1周后采用免疫組化法檢測小鼠腦內(nèi)hUC-MSCs的遷移率，3周后采用Morris水迷宮測試各組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，同時檢測小鼠血清中SOD的活性和MDA的含量，并采用qRT-PCR和Western blot檢測小鼠腦組織中衰老相關(guān)基因(sirt2、pCNA、p16、p53)的表達(dá)。結(jié)果：APP+組和rhMG53組未見hUC-MSCs遷移，hUC-MSCs組和聯(lián)合組存在hUC-MSCs遷移，且聯(lián)合組遷移細(xì)胞更多(P<0.05)。hUC-MSCs移植可以使APP+小鼠的逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加以及平臺所在象限停留時間增加(P<0.05)；hUC-MSCs移植和rhMG53均可使APP+小鼠血清SOD活性增加，MDA含量下降，且二者聯(lián)用對MDA的影響有協(xié)同作用(P<0.05)；hUC-MSCs移植和rhMG53均可使APP+小鼠腦組織sirt2和pCNA mRNA和蛋白的相對表達(dá)量升高，且二者聯(lián)用對多數(shù)衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響有交互作用(P<0.05)。結(jié)論：外源rhMG53蛋白可以提高小鼠腦內(nèi)hUC-MSCs的遷移，促進(jìn)hUC-MSCs對阿爾茨海默鼠的治療作用。

干細(xì)胞移植為腦損傷、脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病的治療帶來了希望，取得了令人鼓舞的結(jié)果[1]。但是損傷部位的微環(huán)境導(dǎo)致移植后干細(xì)胞的存活率低且遷移至損傷組織的數(shù)量少，從而影響了治療效果[2]。因此，增強(qiáng)干細(xì)胞的靶向遷移能力、增加到達(dá)損傷區(qū)的移植細(xì)胞的數(shù)量是目前亟待解決的問題。研究[3]表明外源的重組人MG53蛋白(recombinant human mitsugumin 53 protein，rhMG53)對于各種肌肉或非肌肉細(xì)胞(骨骼肌、心肌、上皮、免疫和神經(jīng)細(xì)胞以及胚胎腭突間充質(zhì)細(xì)胞)損傷均有保護(hù)作用，可快速定位到損傷部位，在細(xì)胞膜修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用；此外，rhMG53蛋白對肺、心肌損傷等急性損傷具有損傷保護(hù)和修復(fù)治療作用[4-5]。那么rhMG53蛋白在阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)慢性病理環(huán)境下對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)移植治療是否具有促進(jìn)作用？該研究觀察了rhMG53聯(lián)合hUC-MSCs移植對AD模型小鼠的治療作用。

1材料與方法

1.1材料rhMG53由美國俄亥俄州州立大學(xué)麻建杰教授提供；hUC-MSCs由課題組前期凍存；DMEM/F12培養(yǎng)基、免疫組化試劑盒購自寶信生物科技有限公司；胎牛血清購自美國Gemini公司；DNA小提試劑盒、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司；引物，兔抗人抗體(Sirt2、PCNA、P16、P53)，鼠抗人MAB1281單克隆抗體購自生工生物工程(上海)股份有限公司；血清SOD活性測定試劑盒及血清MDA含量測定試劑盒購自南京建成生物公司。

1.2AD模型小鼠的鑒定與分組清潔級C57BL/6 APP轉(zhuǎn)基因小鼠購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)動物所，合籠繁殖。實(shí)驗(yàn)選用4月齡小鼠，采用PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定：剪取0.3 cm鼠尾，提取全DNA，PCR擴(kuò)增APP基因，擴(kuò)增引物序列為： 5’-CCCTGAACCT GAAACATAAAAT-3’和5’-GCTACGAAAATCCAAC CTACAA-3’，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳共鑒定出40只APP+小鼠，然后按隨機(jī)數(shù)字表法分為APP+組、hUC-MSCs組、rhMG53組和rhMG53聯(lián)合hUC-MSCs組(聯(lián)合組)，每組10只。APP+組小鼠通過尾靜脈注射0.2 mL生理鹽水，hUC-MSCs組同法注射0.2 mL細(xì)胞密度為5×106mL-1的第3代hUC-MSCs懸液，rhMG53組按2 mg/kg注射0.2 mL rhMG53，聯(lián)合組小鼠注射含細(xì)胞密度為5×106mL-1的第3代hUC-MSCs和含rhMG53(2 mg/kg) 的混合液0.2 mL。1次/d，共3 d。

1.4Morris水迷宮檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力小鼠注射結(jié)束后3周進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練1周，然后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。撤去平臺，小鼠分別從4個象限的固定位置入水，觀察并利用攝像采集器記錄小鼠游泳軌跡，統(tǒng)計(jì)穿越平臺次數(shù)、逃避潛伏期和平臺所在象限停留時間等參數(shù)。

1.5小鼠血清SOD活性和MDA含量檢測Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組分別選取3只小鼠，活體心臟取血，2 000×g離心5 min，收集上清，-80 ℃保存。根據(jù)南京建成生物公司試劑盒說明書推薦方法使用酶標(biāo)儀檢測小鼠血清中SOD活性，使用分光光度法檢測小鼠血清中MDA含量。

1.6小鼠腦組織衰老相關(guān)基因(sirt2、pCNA、p16、p53)mRNA和蛋白表達(dá)的檢測Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組分別取3只小鼠，處死后取出腦組織，勻漿后Trizol裂解法提取總RNA，測RNA濃度和完整性后-80 ℃保存。取500 ng總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以小鼠GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，進(jìn)行qRT-PCR，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。數(shù)據(jù)分析采用比較Ct法，相對表達(dá)量=2-ΔΔCt，重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)所用相關(guān)引物序列參考課題組前期文獻(xiàn)[6]報(bào)道。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較hUC-MSCs組和聯(lián)合組hUC-MSCs遷移數(shù)量，應(yīng)用析因設(shè)計(jì)的方差分析比較rhMG53和hUC-MSCs移植對水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果、血清中SOD活性及MDA含量、腦組織中衰老相關(guān)基因mRNA及蛋白相對表達(dá)量的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1APP轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示在284 bp處有條帶(圖1)，為APP轉(zhuǎn)基因鼠，共獲得40只APP+小鼠。

M：100 bp Marker；1和6為APP-小鼠，其余為APP+小鼠。圖1　APP轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.24組小鼠腦組織hUC-MSCs的遷移APP+組和rhMG53組未見hUC-MSCs遷移，hUC-MSCs組和聯(lián)合組小鼠腦組織中hUC-MSCs的遷移數(shù)分別為(54.66±3.53)和(129.33±4.97) mm-2，且聯(lián)合組高于hUC-MSCs組(t=12.238,P<0.001)。

2.34組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的檢測Morris水迷宮測試結(jié)果見表1。hUC-MSCs移植可使APP+小鼠的逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)以及平臺所在象限停留時間增加。

表1　4組小鼠水迷宮測試結(jié)果

2.44組小鼠血清SOD活性及MDA含量的比較見表2。hUC-MSCs移植和rhMG53均可使APP+小鼠血清中SOD活性增加，MDA含量下降，二者聯(lián)用對MDA的影響具有協(xié)同效應(yīng)。

表2　4組小鼠血清SOD活性及MDA含量的變化

2.54組小鼠腦組織中衰老相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)量的變化結(jié)果見圖2，表3、4。

1～4：分別為APP+組、hUC-MSCs組、rhMG53組和聯(lián)合組。圖2　4組小鼠腦組織中衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)

hUC-MSCs移植和rhMG53均可使小鼠腦組織中sirt2和pCNA基因mRNA和蛋白的相對表達(dá)量升高，p16、p53 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量下降；hUC-MSCs與rhMG53聯(lián)用對多數(shù)衰老基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響有協(xié)同作用。

表3　4組小鼠腦組織中衰老相關(guān)基因mRNA的表達(dá)變化

表4　4組小鼠腦組織中衰老相關(guān)基因蛋白水平的表達(dá)變化

3討論

AD是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙和行為異常[7]。干細(xì)胞通過替代受損神經(jīng)元或者分泌營養(yǎng)因子對AD起到治療作用[8]。提高外源性干細(xì)胞在腦內(nèi)的存活和遷移效率是提高干細(xì)胞治療效果亟待解決的問題[9]。

MG53蛋白在腦組織中不表達(dá)[10]，但能夠保護(hù)體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，參與神經(jīng)細(xì)胞的損傷修復(fù)[3]；而且rhMG53能夠保護(hù)體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免受氧化損傷[11]。該研究以外源rhMG53蛋白為切入點(diǎn)，研究rhMG53對hUC-MSCs治療APP+鼠的影響。作者首先采用Morris水迷宮測試了各組小鼠行為學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs移植可使AD小鼠逃避潛伏期縮短、穿越平臺次數(shù)增多、平臺所在象限停留時間增加，與已有文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道一致，但未發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs和rhMG53有協(xié)同作用。MAB1281是人細(xì)胞核的特異性抗體，用MAB1281作為指示能夠鑒定外源的hUC-MSCs在小鼠組織中的遷移。該研究發(fā)現(xiàn)rhMG53聯(lián)合hUC-MSCs治療組較單用hUC-MSCs組hUC-MSCs的遷移明顯增多，說明rhMG53對體內(nèi)hUC-MSCs的損傷發(fā)揮保護(hù)作用，并促進(jìn)其存活和遷移。生化水平上，SOD活性直接反映機(jī)體清除自由基的能力，而MDA含量反映了機(jī)體內(nèi)自由基積累程度和脂質(zhì)過氧化損傷程度，二者可反映體內(nèi)的氧化水平。該研究結(jié)果顯示hUC-MSCs移植可使小鼠血清SOD活性升高，MDA含量降低，說明機(jī)體的抗氧化水平提高，降低了氧化應(yīng)激的損害，且聯(lián)合組血清MDA含量較hUC-MSCs組更低。分子水平上，作者檢測了腦組織中衰老相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rhMG53和hUC-MSCs移植均可使增殖活力相關(guān)基因sirt2、pCNA的表達(dá)增加，而衰老相關(guān)基因p16、p53的表達(dá)降低，說明rhMG53和hUC-MSCs移植能夠不同程度提高腦組織細(xì)胞的活力，延緩AD小鼠的衰老，并且二者聯(lián)用對多數(shù)衰老相關(guān)基因有協(xié)同作用。

綜上所述，hUC-MSCs可以改善AD鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，提高小鼠體內(nèi)的抗氧化水平、延緩AD的衰老進(jìn)程；rhMG53可促進(jìn)hUC-MSCs的遷移和存活，二者聯(lián)合較hUC-MSCs單一治療效果更加明顯，可能在AD治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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(2015-10-29收稿責(zé)任編輯徐春燕)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.002

#通信作者：關(guān)方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)， E-mail: guanfangxia@126.com；馬珊珊，女，1984年5月生，博士，副教授，研究方向:干細(xì)胞生物學(xué)特性分析，E-mail: mashanshan84@163.com

中圖分類號R592

關(guān)鍵詞rhMG53；阿爾茨海默??；間充質(zhì)干細(xì)胞；干細(xì)胞移植；小鼠

Therapeutic effects of rhMG53 combination with hUC-MSCs transplantation on Alzheimer′s disease mice

SONG Jishi1), MA Shanshan1), MENG Nan2), WANG Xinxin2), YAO Ning3), ZHU Xiangzhan3), CHENG Kang1), YANG Bo2), GUAN Fangxia1,2)

1)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500523)China-US(Henan)HormelCancerInstitute，Zhengzhou450000

Key wordsrhMG53;Alzheimer′s disease;mesenchymal stem cell;stem cell transplantation；mouse

AbstractAim: To research the effects of rhMG53 combination with hUC-MSCs transplantation on Alzheimer′s disease mice. Methods: Forty APP+ mice were randomly allocated into four groups: APP+ group, hUC-MSCs group, rhMG53 group and rhMG53 combined with hUC-MSCs group. The migration of hUC-MSCs was quantified by immunohistochemistry at one week after transplantation. And the learning and memory ability was measured by Morris water maze test at three weeks after transplantation. The activity of superoxide dismutase(SOD) and the concentration of malonaldehyde(MDA) in the serum were also quantified. qRT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of senescence related factors(sirt2,pCNA,p16,p53). Results: No migration of hUC-MSCs was found in APP+ group or rhMG53 group, while it was observed in the hUC-MSCs group and the combined group, and the amount of migration cells was higher in the combined group(P<0.05). hUC-MSCs transplantation decreased the escaping latency, increased the times of crossing platform and the time spent in the platform quadrant(P<0.05). hUC-MSCs transplantation and rhMG53 could both increase the activity of SOD and decrease the content of MDA in the serum of APP+ mice, and rhMG53 combined with hUC-MSCs transplantation had synergistic effect on MDA(P<0.05). hUC-MSCs transplantation and rhMG53 could both increase the expressions of sirt2 and pCNA mRNA and protein in the brain tissue of APP+ mice, and rhMG53 combined with hUC-MSCs transplantation had synergistic effect on the expression of most aging genes(P<0.05).Conclusion: rhMG53 can improve the migration of hUC-MSCs in brain tissue of APP+ mice, and promote the therapeutic effect of hUC-MSCs on APP+ mice.

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目81471306,U1404313；河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃154200510008；河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃15IRTSTHN022；河南省產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目142107000008