張清秀，李啟亮，董　方，甄景慧

(首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院檢驗中心，北京 100045)

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UF-1000i尿液分析儀鑒別兒童尿路感染細菌類型探討

張清秀，李啟亮，董方，甄景慧

(首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院檢驗中心，北京 100045)

[摘要]目的通過全自動尿液分析儀細菌通道參數(shù)與細菌培養(yǎng)的分析比較，從而建立一種快速準確的兒童尿路感染初篩方法。方法選擇北京兒童醫(yī)院2015年1至5月疑似尿路感染患兒中段尿649例，同時進行細菌培養(yǎng)和UF-1000i尿沉渣定量分析。將尿液細菌培養(yǎng)結果作為金標準，與尿液分析儀通道細菌參數(shù)[前向散射光(B-FSC)，熒光強度(B-FLH)]進行分析比較，通過ROC曲線分析，計算出診斷兒童尿路感染的最佳臨界值。結果①624例患兒標本中細菌培養(yǎng)陽性220例，陽性率35.3%，共分離細菌238株，其中革蘭陰性菌153株，革蘭陽性菌73株，真菌12株；②建立尿液分析儀白細胞和細菌參數(shù)的最佳臨界值43/ L和474.4/ L，其診斷尿路感染的靈敏度76.6%、83.3%，特異性75.5%、79.2%，約登指數(shù)51.2%、62.5%，漏診率23.4%、16.7%，誤診率25.4%、20.8%，陽性預測值64.5%、71.4%，陰性預測值74.6%、88.4%，陽性似然比3.12、4.00，陰性似然比0.31、0.21；③革蘭陰性菌B-FSC均值與革蘭陽性菌均值差異均有顯著性意義(t=2.183，P<0.05)。B-FLH在區(qū)別革蘭陰性菌和革蘭陽性菌差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；④以B-FSC<37ch和B-FSC/B-FLH<0.4為臨界值，判斷革蘭陰性菌的靈敏度分別為85.5%、91.6%，特異性86.4%、89.8%，約登指數(shù)71.9%、81.4%，漏診率14.5%、8.4%，誤診率13.6%、10.2%，陽性預測值93.3%、95.2%，陰性預測值72.9%、82.8%，陽性似然比6.29、8.98，陰性似然比0.17、0.09。結論在兒童尿路感染中，細菌參數(shù)B-FSC能有效地區(qū)別革蘭陰性菌和革蘭陽性菌，B-FSC/B-FLH<0.4區(qū)別革蘭陰性菌和革蘭陽性菌優(yōu)于B-FSC<37ch。建立實驗室最佳臨界值可幫助快速診斷兒童尿路感染及鑒別細菌類型。

[關鍵詞]兒童尿路感染；全自動尿液分析儀；細菌通道參數(shù)前向散射光和熒光強度；ROC曲線分析

目前尿路感染的實驗室診斷“金標準”主要依靠定量中段尿細菌培養(yǎng)，此診斷一般需要3天至4天時間，且有70%的陰性率或3種以上混合細菌生長。兒童留取中段尿較成人困難，同時處理不當可能造成結果假陽性或假陰性。UF-1000i全自動尿液分析儀采用半導體激光流式細胞/核酸熒光染色技術，具有雙通道(沉渣通道、細菌通道)檢測標本，沉渣通道增加了側向散射光強度(S-SSC)，對檢測的標本可以精確定量細菌，并且大大消除了干擾物質(zhì)對細菌檢測結果的影響。本文對649例清潔尿標本進行了全自動尿液分析和尿液細菌培養(yǎng)，通過尿液細菌通道參數(shù)前向散射光(B-FSC)和熒光強度(B-FLH)數(shù)值的變化特點初步篩查陽性菌和陰性菌，為聯(lián)合診斷兒童尿路細菌感染和提前進行抗生素經(jīng)驗性治療提供幫助，掌握最佳治療時機。

1資料和方法

1.1一般資料

2015年1至5月在首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院收集臨床表現(xiàn)包括尿頻、尿急、排尿不暢、下腹部不適或伴發(fā)熱的患兒649例，其中男339例，女310例；最小年齡16天，最大年齡15歲。以苯扎溴銨或碘伏清潔外陰及尿道口周圍，除嬰幼兒留置無菌尿袋，其余患兒均留取清晨中段尿，并立即送檢，先進行尿細菌培養(yǎng)后再進行尿沉渣分析，均在1小時內(nèi)完成。

1.2儀器與試劑

UF-1000i全自動尿液分析儀、質(zhì)控品(批號：YS4028L和YS4028H)、配套試劑均為日本希森美康電子有限公司生產(chǎn)。VITEK2 Compat全自動細菌鑒定藥敏分析儀、配套試劑以及血平板、麥康凱平板均為法國梅里埃(上海)生物制品有限公司提供。

1.3尿培養(yǎng)、細菌鑒定及藥敏分析

嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》3版(2006年中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司編制)進行操作。用定量加液器取尿液10 L，接種于血平板和麥康凱平板上，經(jīng)過35℃二氧化碳孵箱中培養(yǎng)過夜，經(jīng)18～24小時檢查細菌生長情況，計算菌落數(shù)，挑取可疑菌落采用VITEK2 Compat全自動細菌鑒定儀對細菌進行鑒定，未生長的標本繼續(xù)培養(yǎng)24小時后觀察有無細菌生長。凡革蘭陰性菌>105cfu/mL，革蘭陽性菌>104cfu/mL視為定量細菌培養(yǎng)陽性。若有3種以上雜菌生長，則視為混合污染重新送檢。

細菌接種后，將尿液用UF-1000i全自動尿液分析儀進行分析，嚴格按照儀器要求在1個小時內(nèi)完成檢測。同時記錄儀器白細胞數(shù)、細菌數(shù)及細菌通道參數(shù)B-FSC和B-FLH數(shù)值(單位：ch)。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，指標的診斷性能評價采用ROC曲線及曲線下面積計算。計數(shù)資料用率表示，組間率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 220例中段尿培養(yǎng)陽性的主要病原菌情況

在649例患兒中，有25例患兒出現(xiàn)3種以上雜菌，考慮污染，不計數(shù)在內(nèi)；其余624例檢測標本經(jīng)細菌培養(yǎng)，鑒定有220例患兒標本培養(yǎng)陽性，陽性率35.3%。本次共分離細菌238株，其中革蘭陰性菌153株，革蘭陽性菌73株，真菌12株，以陰性菌為主(同一患者1次病程中多次檢測出同1種菌按1株計算)。統(tǒng)計男121例，占總陽性率55.0%；女99例，占總陽性率45.0%，男、女細菌培養(yǎng)陽性分離率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.918，P=0.338)。在陽性分離標本中，單一細菌感染190例，兩種細菌感染18例(分別符合革蘭陰性菌>105cfu/mL，革蘭陽性菌>104cfu/mL標準)，真菌感染12例。各主要病原菌的分布構成比見表1。

表1220例兒童中段尿培養(yǎng)主要病原菌結果

Table 1　Main pathogenic bacteria isolated from midstream urine culture among 220 cases of children

2.2繪制ROC曲線確定白細胞及細菌計數(shù)最佳臨界值

UF-1000i全自動尿液分析儀的白細胞(WBC)計數(shù)和細菌數(shù)量(BACT)在目前是診斷兒童尿路感染的兩個輔助指標，其方便、快速。以尿液細菌培養(yǎng)結果作為金標準，將WBC和細菌計數(shù)的結果繪制成ROC曲線，見圖1。

注：細菌計數(shù)的曲線下面積略高于WBC；通過ROC曲線分析，計算出診斷尿路感染的WBC和細菌數(shù)量的最佳臨界值，分別為43/L和474.4/L，WBC和細菌數(shù)量的曲線下面積分別為0.872(95%可信區(qū)間0.884～0.900)，0.881(95%可信區(qū)間0.854～0.907)。

圖1白細胞計數(shù)和細菌數(shù)量的ROC曲線

Fig.1ROC curve of white blood cells count and bacteria count

2.3計算前向散射光和熒光強度在不同細菌類型的平均值

在革蘭陰性菌中，計算UF-1000i參數(shù)B-FSC平均值為29.1ch(95%可信區(qū)間19.201～45.901)，革蘭陽性菌參數(shù)B-FSC平均值為58.3ch(95%可信區(qū)間24.921～93.211)，革蘭陰性菌B-FSC明顯低于革蘭陽性菌，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.183，P<0.05)。革蘭陰性菌B-FLH平均值為101.24ch(95%可信區(qū)間95.311～106.071)；革蘭陽性菌B-FLH平均值為107.15ch(95%可信區(qū)間101.031～116.531)，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.512，P>0.05)。

2.4以前向散射光<37ch和前向散射光/熒光強度<0.4為臨界值革蘭陽性、陰性菌的分布情況

細菌培養(yǎng)陽性標本中，單一細菌感染190例，其中革蘭陰性菌131例，革蘭陽性菌59例。有63.2%(120/190)例標本的B-FSC低于37ch；66.3%(126/190)例標本的B-FSC/B-FLH比值低于0.4ch；以B-FSC<37ch和B-FSC/B-FLH<0.4為臨界值，區(qū)分革蘭陰性菌和革蘭陽性菌，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，見表2。

表2UF-1000i細菌參數(shù)不同臨界值革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的分布特點[n(%)]

Table 2 The distribution characteristics of Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria under conditions of different threshold value of UF-1000i bacterial parameters[n(%)]

細菌類型標本總數(shù)(n=190)B-FSC<37ch(n=120)B-FSC/B-FLH<0.4(n=126)革蘭陰性菌G-131(68.9)112(93.3)120(95.2)革蘭陽性菌G+59(31.1)8(6.7)6(4.8)χ290.469103.824P<0.01<0.01

2.5白細胞、細菌計數(shù)診斷兒童尿路感染與前向散射光、熒光強度鑒別細菌類型的診斷效能分析

細菌計數(shù)的靈敏度和特異性均高于WBC，兩者陰性預測值均高于陽性預測值；以B-FSC<37ch和B-FSC/B-FLH<0.4為臨界值，靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值均較高，可以有效的區(qū)分革蘭陰性菌和革蘭陽性菌，見表3。

表3　WBC、細菌計數(shù)診斷兒童尿路感染與B-FSC、B-FLH鑒別細菌類型的診斷效能分析

3討論

3.1引起兒童尿路感染主要致病菌的分析

當患者具有先天性泌尿生殖系統(tǒng)異常、尿路結石等疾病，或者機體免疫功能低下時，均可引起尿液滯留，從而降低膀胱防御細菌的能力，腸道正常菌群在泌尿道進行繁殖，最終導致尿路感染[1-2]。另外醫(yī)務人員在給患者做檢查時，由于環(huán)境、醫(yī)療器械、醫(yī)用物品滅菌不合格等因素也可造成醫(yī)源性感染[3]。兒童尿路感染也是嬰幼兒多發(fā)疾病，嬰幼兒期排尿癥狀多不明顯，家長不易發(fā)現(xiàn)，如果治療不及時，容易造成腎炎，甚至腎衰竭。本研究中，624例患兒中段尿細菌培養(yǎng)，有220例病原菌陽性，主要以革蘭陰性菌為主，共153株，占64.3%(153/238)，其中以大腸埃希菌居多，共檢出88株，占總檢出率的37.0%；其次是銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌。革蘭陽性菌共檢出73株，占30.7%(73/238)，其中以屎腸球菌居多，共檢出53株，占總檢出率的22.3%，與其他文獻一致[4-5]。真菌12株，占5.0%(12/238)，其中以白色念珠菌為主，共9株占總檢出率的3.8%。因此提示腸桿菌科的細菌，尤其大腸埃希菌是引起兒童尿路感染的主要致病菌，其次為銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌。

3.2尿液白細胞計數(shù)和細菌計數(shù)應用于兒童尿路感染診斷中最佳截斷值的探討

以靈敏度為縱坐標，以1-特異性為橫坐標，繪制ROC曲線。確定WBC和細菌計數(shù)的最佳臨界值分別為43/L和474.4/L，與Broeren等[6]報道的相比較高。本研究顯示，WBC靈敏度76.6%，陰性預測值74.6%；細菌計數(shù)的靈敏度83.3%，陰性預測值88.4%。UF-1000i細菌計數(shù)與金標準的符合程度高于WBC，兩者的陰性預測值均高于陽性預測值，因而不能作為尿路感染的確診指標。UF-1000i細菌計數(shù)的陽性率(44.9%)高于尿培養(yǎng)陽性率(35.3%)，分析其原因，一是活菌和死菌的區(qū)別，UF-1000i全自動尿液分析儀對尿中所有的細菌進行計數(shù)，包括活菌和死菌，而尿細菌培養(yǎng)只有活菌才能在培養(yǎng)基中生長，導致兩種方法陽性率的差別；二是有些細菌在Cled培養(yǎng)基中處于靜止狀態(tài)，需要特殊培養(yǎng)基才能生長[7]。尿液分析儀WBC易受包括細菌、扁平上皮、小圓上皮、和脂肪滴等影響，造成假陽性。另外一些藥物的影響也會導致兒童尿液分析結果假性升高。

3.3 UF-1000i尿液分析儀的前向散射光和熒光強度在鑒別兒童尿路感染細菌類型中的應用

中段尿定量細菌培養(yǎng)作為診斷尿路感染的金標準，其培養(yǎng)時間長，并且受很多因素的影響，比如培養(yǎng)基的品種、質(zhì)量等。找到快速區(qū)分革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的方法，在臨床上及時給予治療和干預，對兒童尿路感染非常重要。本文研究了UF-1000i中B-FSC和B-FLH在不同類型細菌的變化特點。計算革蘭陰性菌B-FSC平均值29.1ch低于革蘭陽性菌B-FSC平均值58.3ch，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.017)。革蘭陰性菌B-FLH平均值101.24ch與革蘭陽性菌B-FLH平

均值107.15ch差異無統(tǒng)計學意義(P=0.367)。B-FSC能有效區(qū)分革蘭陰性菌和革蘭陽性菌，而B-FLH在區(qū)分革蘭陰性菌與革蘭陽性菌無顯著差異，與萬楠等[8]的評估結果相同。這樣的結果可以分析為：B-FSC反映了粒子或細菌散點等的大小，而革蘭陽性菌多為不規(guī)則的鏈狀或葡萄狀排列，常被認作大粒子進行通道檢測，因而革蘭陽性菌多數(shù)標本B-FSC>37ch；而B-FLH反映了粒子或細菌散點細胞核染色程度，細菌以外的細胞成分及微小碎片不被染色，可能跟陰、陽兩種菌的細菌核酸與多次甲基染料結合相似有關。在220例細菌培養(yǎng)陽性中兩種細菌感染者18例，計算B-FSC平均值45.5ch，高于革蘭陰性菌而低于革蘭陽性菌的均值。B-FLH均值為105.23ch，與革蘭陰性菌和革蘭陽性菌相當。真菌感染12例，B-FSC平均值63.2ch，高于革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的均值。同時兩種細菌感染的標本較少，未做進一步統(tǒng)計分析。在190例單一細菌感染中，革蘭陰性菌131例，革蘭陽性菌59例。本實驗以B-FSC<37ch為臨界值，革蘭陰性菌93.3%(112/120)，革蘭陽性菌6.7%(8/120)，χ2=90.469，P<0.01；以B-FSC/B-FLH<0.4ch為臨界值，革蘭陰性菌95.2%(120/126)，革蘭陽性菌4.8%(6/126)，χ2=103.824，P<0.01。以上兩種參數(shù)均可區(qū)分革蘭陰性菌和革蘭陽性菌，因此認為患兒感染革蘭陰性菌的可能性比較大，與盧麗萍等[9]的研究結果一致。本實驗還得出以B-FSC/B-FLH<0.4ch為臨界值的靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值等指標均優(yōu)于以B-FSC<37ch為臨界值的指標，在鑒別革蘭陰性菌和革蘭陽性菌優(yōu)勢更加突出。

通過本研究，UF-1000i全自動尿液分析儀的參數(shù)可以幫助臨床盡早篩查兒童尿路感染，同時鑒別出哪種類型細菌感染，及時對患兒給予抗生素治療，但B-FSC和B-FLH在鑒別不同類型細菌的研究中，還需要大量數(shù)據(jù)分析以確立自己實驗室的臨界值水平，把漏診率和誤診率降到最低。

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[專業(yè)責任編輯：孫曉勉]

[收稿日期]2016-03-27

[作者簡介]張清秀(1974-)，女，主管技師，主要從事臨床檢驗工作。

[通訊作者]李啟亮，副主任技師。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.07.015

[中圖分類號]R725.7

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5293(2016)07-0831-03

Exploratory study on using UF-1000i urine analyzer to identify types of bacteria in children with urinary tract infection

ZHANG Qing-xiu, LI Qi-liang, DONG Fang, ZHEN Jing-hui

(Laboratory Center, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045, China)

[Abstract]Objective To establish a rapid and accurate method for preliminary screening of pediatric urinary tract infection (UTI) by comparing the bacteria channel parameters of automated urine analyzer (AUA) and results of bacteria culture. Methods Midstream urines of 649 cases of children with suspected UTI were collected from Beijing Children’s Hospital from January to May in 2015. Bacteria culture of the urine and quantitative analysis of urine sediment were performed simultaneously. Results of bacteria culture were set as the golden standard and were compared with bacteria channel parameters (B-FSC and B-FLH) obtained by Urine Analyzer. The optimal threshold value for the diagnosis of UTI in children was calculated through receiver operating characteristic (ROC) curve analysis. Results Among 624 cases of samples, positive results of bacterial culture were found in 220 samples (35.3%). In total, 238 bacteria strains were isolated, including 153 strains of Gram-negative bacteria, 73 strains of Gram-positive bacteria and 12 strains of fungi. With the aid of AUA, results showed that the optimal threshold value of white blood cells and bacterial parameter was 43/ l and 474.4/ l, respectively. Their sensitivity for the diagnosis of UTI was 76.6% and 83.3%, specificity was 75.5% and 79.2%, Youden index was 51.2% and 62.5%, respectively. In addition, the rate of missed diagnosis was 23.4% and 16.7%, misdiagnosis rate was 25.4% and 20.8%, positive predictive value was 64.5% and 71.4%, respectively, negative predictive value was 74.6% and 88.4%, positive likelihood ratio was 3.12 and 4.00, and negative likelihood ratio was 0.31 and 0.21, respectively. Significant difference was identified between Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria in the mean value of B-FSC (t=2.183, P<0.05). No statistically significant difference was noted between Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria in B-FLH (P>0.05). When setting B-FSC<37ch and B-FSC/B-FLH<0.4 as threshold values, the sensitivity for Gram-negative bacteria was 85.5% and 91.6%, specificity was 86.4% and 89.8%, Youden index was 71.9% and 81.4%, rate of missed diagnosis was 14.5% and 8.4%, misdiagnosis rate was 13.6% and 10.2%, positive predictive value was 93.3% and 95.2%, negative predictive value was 72.9% and 82.8%, positive likelihood ratio was 6.29 and 8.98, and negative likelihood ratio was 0.17 and 0.09, respectively. Conclusion The bacterial parameter B-FSC can effectively differentiate Gram-negative bacteria from Gram-positive bacteria in children with UTI. The threshold value B-FSC/B-FLH<0.4 is more sensitive than B-FSC<37ch in the differentiation of Gram-negative bacteria from Gram-positive bacteria. Setting up a laboratory optimal threshold is helpful to the quick diagnosis of UTI in children and the identification of the types of bacteria.

[Key words]urinary tract infection in children; automatic urine analyzer (AUA); bacterial channel parameters (B-FSC and B-FLH); receiver operating characteristic (ROC) curve