韓　旭，王笑笑，姜同英，王思玲

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·藥學研究·

溶菌酶眼用膜劑的制備及相關性質考察

韓旭1*，王笑笑2，姜同英2，王思玲2

1.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院藥劑科，沈陽 110002；2.沈陽藥科大學藥學院，沈陽 110016

[摘要]目的制備溶菌酶眼用膜劑，為感染性眼部疾病提供新的藥物治療。方法以脫膜性、粘附性、柔韌度、膜性能等相關指標為依據，篩選處方，采用涂膜法制備了溶菌酶眼用膜劑，并考察眼用膜劑的體外釋放特性及眼部刺激性。結果以PVA124為膜材、甘油為增塑劑制備的眼用膜劑，8 h時累計釋放量達到80%以上，對家兔眼部單次及多次給藥后，根據評分標準，評分均為0，多次給藥后的組織病理切片表明，給藥組家兔虹膜有輕微充血。結論溶菌酶眼用膜劑制備工藝簡單，符合眼部用藥標準。

[關鍵詞]眼用膜劑；溶菌酶；體外釋放；眼部刺激性

0　引言

眼膜劑系指藥物與高分子聚合物制成的無菌藥膜?？芍糜诮Y膜囊內緩慢釋放藥物的眼用固體制劑。其特點是：藥物以膜為載體，藥膜在眼結膜囊內被淚液逐漸溶解，由于藥液黏度大，不易溢出，減少了從鼻淚管中流出的損失，因此，能使藥物在眼結膜囊中維持較久、有效的治療濃度，解決了滴眼液眼部藥物利用度低和眼膏劑使眼部不適的問題。

用于治療感染性眼病的藥物主要為抗菌藥物滴眼液，但是其具有耐藥性、不良反應大等缺點，且用于治療細菌和病毒交叉感染的眼病效果差。溶菌酶(Lysozyme)是一種存在于人體正常體液及組織中的非特異性免疫因素，既具有抗菌作用又具有抗病毒的作用，且具有來源于生物體、無耐藥性、組織刺激性和毒性極低等優(yōu)點[1]。同時作為淚液的組成成分之一，文獻報道溶菌酶有利于眼睛淚膜的穩(wěn)定[2]，有利于侵入眼睛細菌的清除[3]。因此，溶菌酶在治療感染性眼病方面有令人期待的臨床用途。溶菌酶為生物大分子，在溶液中容易發(fā)生聚集，因此本文制備了溶菌酶眼用膜劑，改善溶菌酶穩(wěn)定性的同時，延長了藥物與眼部的接觸時間，提高了藥物生物利用度。

1　儀器與材料

UV-2000紫外分光光度儀[尤尼柯(上海)儀器有限公司]；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；CP225D電子天平(Sartorius)。PVA124(日本株式會社可樂麗)；PVA1799(天津華昌源化工貿易限公司)；溶菌酶(西寶生物科技有限公司)；溶壁微球菌(南京建成生物有限公司)；Na2HPO4·12H2O(西隴化工股份有限公司)；NaH2PO4·2H2O(西隴化工股份有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉鹽(西隴化工股份有限公司)；生理鹽水(沈陽志鷹制藥廠)。白色家兔，雌雄兼用，體重2.5～3.0 kg，沈陽藥科大學實驗動物中心提供。實驗前24 h自由進食，飲水，并進行眼部檢查，以確保無任何眼部疾病。

2　方法與結果

2.1溶菌酶眼用膜劑的制備

2.1.1膜材料的篩選通過文獻調研[4]，聚乙烯醇(PVA)是常用的成膜材料。PVA的特點是毒性和刺激性都很小[5]，其水溶液對眼組織不僅無刺激性，還是一種良好的眼球潤濕劑，能在角膜表面形成保護膜，而且不會影響角膜的生理活性，不影響視力[6]。同時，由于PVA表面活性作用使藥物易于穿透角膜，故對深層角膜炎亦有較好的療效[7]。因此初步確定膜材為PVA。選擇PVA兩種常見型號PVA124及PVA1799，通過對脫膜性、粘附性、柔韌度、有無氣泡以及溶化時間等方面考察，確定最終膜材，結果見表1。

表1　成膜材料的篩選

注：溶化時間：在32 ℃時，測定膜溶解的時間

由表1可知，以PVA124為膜材，甘油為增塑劑時，成膜效果及膜的柔軟度較好。

2.1.2膜性能考察膜的性能主要包括薄膜厚度、透光率及膜斷裂伸長率等方面，以下主要考察這3個指標：①薄膜厚度測定：在每張需測定的膜上任取3個點，用薄膜厚度測定儀測定薄膜厚度，并取平均值；②透光度測定：將待測樣品裁切成矩形，貼于比色皿外表面，在500 nm下測定其透光率，以透光率大小來表示膜透明度；③膜斷裂伸長率測定：從膜材上截取長為a(3 cm)，寬為b(1 cm)的一小塊膜，用力拉長至膜剛好斷裂時，測定此時的膜長c，計算c是原長a的倍數。

2.1.3膜厚度對膜性能的影響膜厚度為0.038 mm時，膜的各項指標較好。見表2。

表2　膜厚度對膜性能的影響

2.1.4PVA濃度對膜性能的影響PVA濃度為10%時，膜的各項指標均較合適。見表3。

表3　PVA濃度對膜性能的影響

2.1.4增塑劑(甘油)的篩選甘油濃度為6%時，膜的各項指標較好。見表4。

表4　甘油對膜性能的影響

2.1.5溶菌酶眼用膜劑的最終處方及制備工藝制備工藝：稱取PVA124 5 g，加入適量注射用水分散好，水浴加熱至80 ℃溶解，制成漿液冷卻至室溫，稱取甘油3 g加入其中，攪拌均勻，待用。另稱取溶菌酶0.75 g，用注射用水溶解，加入已溶解成膜材料漿液中攪勻，最終使成膜漿液體積為60 mL。然后將其傾入預先涂有少量液體石蠟的玻璃板上，制膜2 000 cm2，經70～80 ℃的鼓風干燥箱15 min后，立即脫膜，取出，在紫外燈下滅菌30 min，切成0.5 cm×1 cm小塊，無菌包裝。見表5。

表5　溶菌酶眼用膜劑的最終處方

2.2溶菌酶活力測定酶活力測定參照文獻[8]，利用溶菌酶破壞溶壁微球菌細胞壁，從而降低細菌懸浮液濁度的原理，采用分光光度法測定。在25 ℃、pH 6.2的條件下，于450 nm處每分鐘使吸光度值下降0.001即為1個酶活力單位(IU)。由此可得溶菌酶活力的計算公式如下：

單位為U/mg，a和A分別為0 s和60 s的吸光度，a′和A′分別為空白對照溶液的0 s和60 s的吸光度值。

2.3溶菌酶眼用膜劑的含量測定

2.3.1檢測波長的確定稱取溶菌酶25 mg，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.2)溶解并轉移至100 mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH 6.2)稀釋并定容，配制適當濃度的溶菌酶磷酸鹽溶液(約2.5 mg/mL)，取適量溶菌酶眼用膜劑的基質溶解、轉移并定容至100 mL的容量瓶中，以磷酸鹽緩沖液為空白對照，按《中華人民共和國藥典》2010版二部附錄ⅣA紫外分光光度法，在200～400 nm波長范圍內掃描，由結果可知，溶菌酶在281 nm處有最大吸收，在此波長處制劑中輔料對溶菌酶的含量測定沒有影響，因此，選擇281 nm作為溶菌酶含量測定波長。

2.3.2標準曲線的繪制精密稱取溶菌酶對照品100.2 mg，加磷酸鹽緩沖液(pH 6.2)溶解，稀釋定容至100 mL容量瓶中。精密量取上述溶液1、2、3、4、5、6 mL分別至20 mL容量瓶中，加磷酸鹽緩沖液(pH 6.2)稀釋至刻度，搖勻，分別在281 nm處測吸光度，測定3次取平均值。得到吸光度(A)對溶液濃度(C)的工作曲線A=2.398 9 C+0.051 2,R2=0.999 8。濃度范圍為0.05～0.4 mg/mL，濃度與吸光度線性關系良好。

2.3.3方法學驗證①回收率實驗：配制溶菌酶低、中、高濃度分別為0.050 1、0.150 3及0.300 6 mg/mL的樣品溶液，按處方比例加入輔料，按含量測定項下的方法測定，記錄吸光度，代入標準曲線計算，得到回收率分別為101.9%、100.6%和101.9%。

②精密度實驗：配制溶菌酶濃度分別為0.050 1、0.150 3及0.300 6 mg/mL(低、中、高)的樣品溶液，每個濃度配制3份樣品，1 d內重復測定3次，計算日內相對標準偏差；每天測定1次，連續(xù)測定3 d，計算日間相對標準偏差。結果日內相對標準偏差分別為0.1%、0.2%和0.1%，日間相對標準偏差分別為0.9%、1.4%和1.4%，相對標準偏差均小于2%，符合方法學要求。

2.3.4含量測定取10 cm×10 cm(相當于200片)的載藥膜，剪碎，放入燒杯中，加40 mL蒸餾水，在34 ℃水浴，100 r/min轉速放置10 h后，轉移到100 mL容量瓶中定容，再取4 mL至20 mL容量瓶中定容。過0.8 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，在281 nm處測吸光度值A，代入標準曲線計算藥物含量。

2.4溶菌酶眼用膜劑的體外釋放

2.4.1溶菌酶眼用膜劑的體外釋放行為采用Franz立式擴散池法測定溶菌酶眼膜體外釋藥行為，將膜夾在上下兩池之間，膜有效擴散面積0.785 cm2，以脫氣的人工淚液3 mL為溶劑，溫度為34 ℃，轉速為100 r/min。在5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、5 h、8 h分別取樣，每次3 mL，經0.8 μm微孔濾膜過濾，同時補充同溫新鮮介質3 mL，在281 nm處測定吸光度。計算體外釋藥累計釋放量，同時測定釋放過程中的溶菌酶相對活力，結果見圖1。

圖1　溶菌酶眼用膜劑的釋放曲線

由圖1可知，溶菌酶眼用膜劑在體外釋放8 h時，累計釋放量可以達到80%以上，同時在釋放過程中酶的相對活力未發(fā)生改變。

2.4.2溶菌酶眼用膜劑的體外釋放機制[9-10]關于釋藥機制，存在諸多的釋藥模型體系[11-13]。常見有以下4種：零級釋放：Q=a+bt；一級釋放：ln(1-Q)=a+bt；Higuchi釋放：Q=a+bt0.5和Ritger-Peppas釋放：lnQ=a+blnt，式中：Q為藥物累計釋放百分數，t為取樣時間，a為常數，b為釋藥速度常數。

對溶菌酶眼用膜劑體外釋藥行為進行以上4種模型的模擬，結果見表5。

表5　溶菌酶眼用膜劑體外釋放方程參數

由表5可知，溶菌酶眼用膜劑就體外釋放曲線對一級釋放方程、Higuchi釋放方程、Ritger-Peppas釋放方程的擬合度都較好。

2.5溶菌酶眼用膜劑的眼部刺激性試驗

2.5.1溶菌酶眼用膜劑對兔眼的單次給藥眼刺激性試驗取健康家兔4只，體重2～3 kg，左眼空白對照，右眼結膜囊內貼入溶菌酶眼用膜劑，貼入后輕輕閉合眼瞼約10 s，分別于點藥后1、2、4、24、48和72 h對眼部進行檢查。根據國家食品藥品監(jiān)督管理局2014年《眼刺激反應分值標準》評分記錄[14]，結果顯示，與對照組相比，給藥組角膜透明，虹膜清晰，結膜未充血，無水腫及分泌物，手電配備放大鏡檢查角膜病變，評分為0。

2.5.2溶菌酶眼用膜劑對兔眼的多次給藥眼刺激性試驗取健康家兔4只，體重2～3 kg，左眼結膜囊內滴入0.1 mL生理鹽水對照，右眼結膜囊內貼入溶菌酶眼用膜劑，貼入后輕輕閉合眼瞼約10 s，每天4次，連續(xù)7 d，每天給藥前及最后一次給藥后1、2、4、24、48及72 h對眼部進行檢查。根據國家食品藥品監(jiān)督管理局2014年《眼刺激反應分值標準》評分記錄，結果顯示，與對照組相比，給藥組角膜透明，虹膜清晰，結膜未充血，無水腫及分泌物，手電配備放大鏡檢查角膜病變，評分為0。

多次刺激性實驗結束后，耳緣靜脈注射空氣處死家兔。從雙側眼角處破開眼眶，突出眼球，剪斷動眼肌及視神經叢，摘除眼球，沖去表面附著的血塊，甲醛溶液(8%，w/v)固定24 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片(厚度10 μm)，脫蠟，蘇木素(Hematologylin)與伊紅(Eosin)對染(H.E.)，脫水，封片，鏡下觀察各實驗組家兔的組織病理切片，結果見圖2、圖3。

圖2　對照組(生理鹽水)家兔的眼部組織病理切片圖

圖3　給藥組(溶菌酶眼用膜劑)家兔的眼部組織病理切片圖

由家兔的組織病理切片結果可知，與對照組相比，給藥組虹膜有輕微充血現象，根據國家食品藥品監(jiān)督管理局2014年《眼刺激反應分值標準》評分記錄，屬于無刺激性。

3　討論

3.1溶菌酶是生物大分子，在體外釋放實驗中，除了考察藥物釋放量之外，還要考慮酶的活性。由體外釋放結果可知，釋放過程中溶菌酶活力基本保持不變，符合制劑要求。膜材PVA為可溶性高分子材料，與角結膜接觸后逐漸被淚液溶解，隨著膜材料的溶解，藥物溶菌酶不斷擴散。溶菌酶眼用膜劑的釋藥行為受擴散和溶蝕的雙重影響。同時，膜材溶解后，表現出一定的黏性，粘附在角膜上，減少了藥物的流失，并延長了藥物的作用時間。

3.2眼睛是高度敏感的器官，其角膜上皮含有豐富的血管末梢神經，所以眼睛對刺激具有高度敏感性。溶菌酶眼用膜劑在兔眼刺激性實驗過程中，在最初放入膜劑的2 min內，家兔眨眼次數較空白對照組增多，隨后恢復正常，表明眼睛對溶菌酶眼用膜劑表現出一定的異物感，隨著膜材的溶解，異物感消失。在多次給藥的眼刺激試驗中，病理組織切片結果反映了外來刺激物對多種組織的刺激效應。除了考察角膜損傷外，還對虹膜、結膜及其周圍組織的炎癥變化進行了全面系統(tǒng)的評價[15]。溶菌酶眼用膜劑使家兔虹膜輕微充血，但根據評分標準，仍屬無刺激結果。

蛋白類藥物溶菌酶制備成膜劑可以很好地避免其水溶液的不穩(wěn)定性，如聚集和沉淀等，也可以更好地保持其生物活性。延長了藥物與眼部的接觸時間，提高藥物生物利用度。

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收稿日期：2015-10-25

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607028

Preparation and property evaluation of lysozyme ocular film

HAN Xu1*,WANG Xiao-xiao2,JIANG Tong-ying2,WANG Si-ling2

(1.Department of Pharmacy,School of Stomatology,China Medical University,Shenyang 110002,China;2.School of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016,China)

[Abstract]ObjectiveTo prepare and evaluate the lysozyme ocular film as a novel therapy for infectious eye diseases.MethodsVarious preparations were evaluated based on their attachment,detachment,flexibility and film performance.Lysozyme ocular film was prepared with coating method,and in vitro drug release characteristics and eye irritation were assessed.ResultsUsing PVA124 as film-forming material and glycerol as plasticizer,we found that cumulative drug release reached more than 80% at 8 hours.According to evaluation standard,the scores were both 0 for single and multiple dosing in eye irritation experiment in rabbits.Histopathologic examination revealed that multiple dosing of ocular film resulted in slight hyperemia of iris in the rabbit.ConclusionThe preparation process of lysozyme ocular film is simple and in accordance with the standard of ophthalmic drug.

Key words：Ocular film;Lysozyme;In vitro release;Eye irritation