陳舒華　劉丹　張繼平　陳艷瓊　張華宋，2　劉湘　黃澤棋

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不同家族史鼻咽癌患者癌組織Prohibitin的表達(dá)*

陳舒華1劉丹1張繼平1陳艷瓊1張華宋1，2劉湘1黃澤棋1

目的 對(duì)比Prohibitin（PMB）在不同家族史的鼻咽癌患者癌組織中的表達(dá)，以探究鼻咽組織中Prohibitin是否可以作為鼻咽癌潛在標(biāo)記物。方法 收集高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌患者、鼻咽黏膜慢性炎癥患者的鼻咽組織各9例，散發(fā)氣虛質(zhì)鼻咽癌患者的鼻咽組織12例，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)Prohibitin在各組鼻咽組織中的表達(dá)。利用Western-blotting蛋白免疫印跡方法檢測(cè)Prohibitin在各組患者鼻咽組織中的表達(dá)。結(jié)果 PHB mRNA在鼻咽黏膜慢性炎癥鼻咽組織、散發(fā)氣虛質(zhì)鼻咽癌組織、高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組織中的2-△△Ct值分別為1.00±0.72、1.08±0.49、0.97±0.41（P＞0.05）。PHB蛋白相對(duì)表達(dá)依次為0.33± 0.21、0.59±0.25、1.72±0.96（P＜0.05）。分析 各組間對(duì)比PHB基因表達(dá)量無(wú)明顯變化，但蛋白表達(dá)量鼻咽癌患者明顯高于正常人，高癌家系鼻咽癌患者蛋白表達(dá)量高于散發(fā)患者，考慮與級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)有關(guān)，有望成為高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌患者早期診斷及篩查的標(biāo)志物。

鼻咽癌高癌家系；Prohibitin；生物標(biāo)志物；氣虛體質(zhì)

1廣東佛山市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科（524028）

2廣東醫(yī)學(xué)院

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是主要來(lái)源于鼻咽黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其死亡率在中國(guó)居頭頸惡性腫瘤之首。高發(fā)區(qū)主要集中在中國(guó)南部，其中又以廣東省最高發(fā)。與其他頭頸腫瘤比較發(fā)現(xiàn)鼻咽癌與遺傳等因素相關(guān)，表現(xiàn)出明顯的家族聚集現(xiàn)象，鼻咽癌患者的一級(jí)親屬為患鼻咽癌的高危人群［1-7］?？乖鲋车鞍祝≒rohibitin，PHB）廣泛存在于各種生物細(xì)胞和組織中，是一組高度保守的蛋白，具有抗腫瘤增殖活性［8］，與一級(jí)親屬腫瘤患者具有密切相關(guān)性［9］。在本課題組前期［10］研究中證實(shí)鼻咽癌不同體質(zhì)患者鼻咽癌組織中的PHB表達(dá)有所不一。由于蛋白組學(xué)技術(shù)存在本身的缺陷，需進(jìn)一步明確PHB在高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌患者中的表達(dá)差異及驗(yàn)證兩者是否是前期利用蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定出的結(jié)果。同時(shí)為鼻咽癌家族性提供分子水平的依據(jù)，以驗(yàn)證PHB是否能成為鼻咽癌高癌家系生物標(biāo)記物。

資料與方法

1對(duì)象與分組

選取2013年7月～2014年10月在佛山市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科就診的病例，其中高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌患者、鼻咽黏膜慢性炎癥患者的鼻咽組織各9例，散發(fā)氣虛質(zhì)鼻咽癌患者的鼻咽組織12例，本次實(shí)驗(yàn)所取的9例高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌患者的鼻咽組織來(lái)自9個(gè)鼻咽癌高癌家系。高癌家系是指兩代人中有3個(gè)以上成員確診患癌癥，其中二個(gè)以上為鼻咽癌。高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌及散發(fā)氣虛質(zhì)鼻咽癌患者在取標(biāo)本前均未接受過(guò)放化療并均無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；根據(jù)“鼻咽癌2008分期”標(biāo)準(zhǔn)確診；參照周小軍“鼻咽癌家系體質(zhì)調(diào)查研究”（中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2002年第11期）。

2材料

分別取鼻咽組織，-80℃保存。

3RT-PCR

逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）

3.1基因測(cè)序

分別取每個(gè)志愿者一管淋巴細(xì)胞，用RNesy Mini kit（50）分別提取細(xì)胞的基因總RNA，利用美國(guó)賽默飛世爾科技公司Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度，OD值260/280在1.8～2.1范圍內(nèi)的用于下游實(shí)驗(yàn)。取2μg總RNA按照試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄cDNA。

3.2實(shí)時(shí)定量PCR

在Real Time PCR儀器上根據(jù)SYBR-Green半定量進(jìn)行試驗(yàn)，每次試驗(yàn)重復(fù)至少3次。其反應(yīng)體系如下（表1）：

表1　PCR反應(yīng)液的配制

表2　PHB和β-actin引物序列

3.3實(shí)時(shí)定量數(shù)據(jù)處理

反應(yīng)結(jié)束后，利用Real Time PCR儀Mx3005P軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)使用的分析方法為比較Ct值法。根據(jù)公式：ΔCt實(shí)驗(yàn)組=Ct實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因-Ct實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參；ΔCt對(duì)照組=Ct對(duì)照組目標(biāo)基因-Ct對(duì)照組內(nèi)參；ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。此方法要求目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率大致相同。

4Western-blotting蛋白免疫印跡方法檢測(cè)

取20mg組織，加入預(yù)冷的蛋白裂解液（每1ml RIPA加入10ulPMSF混合而成）250ul，冰上玻璃組織勻漿器勻漿，至均漿液透明無(wú)顆粒，將均漿液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5ml的EP管中，12000g離心3～5min，取上清液至新的預(yù)冷的1.5mlEP管，分裝，-80℃保存。應(yīng)用BCA方法進(jìn)行蛋白定量，將蛋白樣品（40μg）與加樣緩沖液混合，100℃煮沸8min，微離心后用于SDS-PAGE凝膠電泳（10%）。電泳完畢后將膠上蛋白半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，膜于5%脫脂牛奶中室溫封閉1h.加l：5000稀釋的一抗（抗肌動(dòng)蛋白抗體）室溫孵育3h，加l：4000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，加ECL反應(yīng)4min，于暗房?jī)?nèi)壓片，顯影。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS18.0軟件處理檢測(cè)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊采用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。不齊則用Welch近似方差分析及Dunnett檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1組間構(gòu)成分析

鼻咽癌高癌家系氣虛癌患者9例，男女比例=7: 2，年齡40.25±13.22歲，家族史回顧：其中一級(jí)親屬患鼻咽癌者7人，肝癌、食道癌各1人。

散發(fā)鼻咽癌患者12例，性別比=3∶1，年齡54± 13.84。

鼻咽黏膜慢性炎癥患者9例，性別比2:1，年齡43±10.72歲。

2RT-PCR

逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）

實(shí)驗(yàn)一結(jié)果顯示PHB基因在各組中的△Ct分別為6.21±0.80，6.00±0.68，6.13±0.58，2-△△Ct值分別為1.00±0.72，1.08±0.49，0.97±0.41（表3）；PHB基因在散發(fā)氣虛質(zhì)鼻咽癌組織、高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組織中的表達(dá)量分別為鼻咽黏膜慢性炎癥鼻咽組織的1.16倍、1.06倍（圖1）。PHB基因各組間表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表3　炎癥組、散發(fā)組、高癌家系組PHB mRNA的相對(duì)表達(dá)

圖1　PHB mRNA在炎癥組、散發(fā)組及高癌家系組中的相對(duì)表達(dá)

3Western-blotting蛋白免疫印跡方法

圖2　PHB蛋白Western blotting蛋白免疫印跡結(jié)果圖

Western blotting結(jié)果顯示（圖2），內(nèi)參蛋白βactin在各組的鼻咽組織中表達(dá)量沒有明顯差異。而PHB與β-actin掃描的OD值比較（表4），在鼻咽黏膜慢性炎癥鼻咽組織組、散發(fā)氣虛質(zhì)鼻咽癌組及高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組中依次為0.33±0.21、0.59± 0.25、1.72±0.96，三組間比較結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），組間兩兩多重比較結(jié)果（表4），在高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組及散發(fā)氣虛質(zhì)鼻咽癌組表達(dá)上調(diào)（圖3）。

表4　三組間PHB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（xˉ±s）

圖3　PHB蛋白相對(duì)表達(dá)量直方圖

討論

鼻咽癌為我國(guó)高發(fā)腫瘤之一，其惡性程度較高。在世界范圍內(nèi)其分布具有明顯區(qū)域性，在歐洲和美國(guó)發(fā)病率較低（0.5-2/100000），我國(guó)為世界鼻咽癌的高發(fā)地區(qū)之一，我國(guó)又以南方發(fā)病率為最高（25/100000），僑居世界各地的華人鼻咽癌發(fā)病率亦居較高水平。國(guó)內(nèi)鼻咽癌分布同樣具有明顯的地區(qū)性差異，其中廣東省中部的肇慶、佛山及廣州為高發(fā)中心，向周圍逐漸降低。與其他頭頸腫瘤不同，鼻咽癌具有明顯的遺傳傾向性，其一級(jí)親屬是患鼻咽癌的高危人群。本研究追蹤鼻咽癌高癌家系氣虛癌患者9例，男女比例=7:2，年齡40.25±13.22歲，家族史回顧：其中一級(jí)親屬患鼻咽癌者7人，肝癌、食道癌各1人。散發(fā)鼻咽癌患者12例，性別比=3∶1，年齡54±13.84歲。鼻咽黏膜慢性炎癥患者9例，性別比2∶1，年齡43±10.72歲。與此前調(diào)查結(jié)果符合，樣本符合流行病學(xué)規(guī)律。

有學(xué)者研究揭示，氣虛質(zhì)是鼻咽癌的敏感體質(zhì)，與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)聯(lián)性，而目前在高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌研究領(lǐng)域國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見報(bào)道，近年來(lái)對(duì)PHB的研究表明，PHB與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，具有重要的生理功能，在多種腫瘤中表達(dá)差異顯著，PHB可能是癌基因產(chǎn)物，或受癌基因或抑癌基因調(diào)控，或通過(guò)某種途徑激活癌基因。本課題組［11，12］通過(guò)2-DE對(duì)高癌家系癌患者癌組織的分析發(fā)現(xiàn)：在與散發(fā)鼻咽癌及正常人對(duì)比組中，均發(fā)現(xiàn)有表達(dá)差異蛋白質(zhì)，其中囊括了PHB。然而仍需進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白及其表達(dá)的差異，所以PHB在鼻咽癌中的表達(dá)值得探究。

PHB與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PHB基因具有明顯的抗細(xì)胞增殖、抗腫瘤作用，故被稱為抗增殖蛋白。人類PHB基因家族包括PHB1、PHB2，分別定位于染色體17q21和染色體12p13。研究發(fā)現(xiàn)，PHB與乳腺癌易感基因（BRAC1）轉(zhuǎn)座子鄰近，意味著PHB與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)［13］。不僅如此，E2F家族中5個(gè)成員在C端均有一個(gè)PHB結(jié)合位點(diǎn)，而E2F與細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤的發(fā)生具有密切關(guān)系，PHB能夠與E2F1及p53共定位于細(xì)胞核，從而使p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)增強(qiáng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期［14］。此外，Ras是一個(gè)原癌基因，能夠激活下游的一些信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用。Ras可以通過(guò)Ras/Raf-1/MAPK信號(hào)通路激活細(xì)胞的增殖與分化；也可以通過(guò)Ras/PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化與遷移；還可以通過(guò)Ras/Ral-GEF/Ral信號(hào)通路將細(xì)胞增殖信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)［15］。研究發(fā)現(xiàn)，PHB在Raf-1的激活中也發(fā)揮著重要作用，可以促進(jìn)上述通路的激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附及遷移［16］。

本次研究通過(guò)Real time PCR技術(shù)及Western blotting技術(shù)分別檢測(cè)PHB mRNA及PHB蛋白在鼻咽黏膜慢性炎癥鼻咽組織、散發(fā)氣虛質(zhì)鼻咽癌組織及高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組織中的表達(dá)量。Real time PCR結(jié)果顯示結(jié)果顯示PHB mRNA表達(dá)量在鼻咽黏膜慢性炎癥鼻咽組織、散發(fā)氣虛質(zhì)鼻咽癌組織、高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組織中無(wú)差異，各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blotting結(jié)果顯示PHB蛋白相對(duì)表達(dá)量在鼻咽黏膜慢性炎癥鼻咽組織、散發(fā)氣虛質(zhì)鼻咽癌組織、高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組織中有顯著差異，各組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組織中PHB蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。PHB蛋白在高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組表達(dá)顯著上調(diào)，與我們前期的蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果相符。本次研究發(fā)現(xiàn)，PHB在基因水平表達(dá)無(wú)差異，在蛋白水平表達(dá)有差異，我們推測(cè)PHB蛋白的翻譯過(guò)程是否受到了某種因素的影響，導(dǎo)致PHB蛋白表達(dá)量增高。已有研究表明，mRNA表達(dá)水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平并不存在著一對(duì)一的關(guān)聯(lián)，兩個(gè)表達(dá)水平之間存在顯著的不平衡性［17］。蛋白質(zhì)是基因的最終產(chǎn)物，也是基因功能的真正執(zhí)行體，但是mRNA由于自身存在貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解、翻譯調(diào)控及產(chǎn)物的翻譯后加工，難以準(zhǔn)確反映蛋白質(zhì)的質(zhì)和量。此外，蛋白質(zhì)翻譯后還存在化學(xué)修飾，比如磷酸化、糖基化等等，這些化學(xué)修飾也可以使蛋白分子的活性增高。Chiu CF等［18］發(fā)現(xiàn)，活化的Ras可以激活PI3K及Akt，磷酸化的Akt又可以相繼激活PHB 及Raf-1；而磷酸化的PHB T258又可以反過(guò)來(lái)激活Ras下游的信號(hào)通路（即PI3K/Akt、Raf-1/MAPK）增強(qiáng)細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，這就是所謂的磷酸化級(jí)聯(lián)現(xiàn)象。那么，我們的研究發(fā)現(xiàn)PHB在基因水平無(wú)差異，而在蛋白水平有差異，是否也是因?yàn)檫@種級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)引起呢？這些都需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索和證明。但是，PHB蛋白在高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組表達(dá)顯著上調(diào)，意味著檢測(cè)癌癥組織中PHB蛋白的表達(dá)情況可能對(duì)高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌患者的早期預(yù)防和早期診斷具有重要意義，PHB有望成為高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌患者早期篩查和早期診斷的分子標(biāo)志物。

本研究存在著樣本量較少、研究方法欠缺多樣化等缺陷，今后將加大樣本量，增加研究方式等進(jìn)一步完善對(duì)PHB和鼻咽癌的探究。PHB可視為鼻咽癌早期診斷，高癌家系檢測(cè)的指標(biāo)之一，對(duì)進(jìn)一步探究鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展規(guī)律、早期診斷、及對(duì)氣虛染毒理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿:2015-08-08修回：2016-04-01）

The expression of Prohibitin in patients with nasopharyngeal carcinoma（NPC）in different family history

CHEN Shuhua，LIU Dan，ZHANG Jiping，CHEN Yanqiong，ZHANG Huasong，LIU Xiang，HUANG Zeqi The Second People's Hospital of Foshan，Guangdong，524028，China

Objective To observe whether Prohibitin（PHB）are differential expression protein in patients with nasopharyngeal carcinoma（NPC）who are Qi-deficiency constitution in familial NPC.To test whether PHB are the key differentially expressed proteins which we have identified previously.Methods It had been collected of 9 cases with Qi deficiency of NPC from familial NPC，12 case with Qi deficiency of NPC from scattered distributed patients，at the same time collecting 9 cases nasopharyngeal tissue from chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa patients，to extract total RNA and protein respectively.The Real Time PCR technology was used to detect the expressions of PHB on the mRNA level and the Western blotting was used to detect the level of PHB.Results the In group of nasopharyngeal tissue from chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa patients，Qi deficiency of nasopharyngeal carcinoma from scatteredly distributed patients and high cancer families，PHB mRNA using Real Time PCR showed that 2-△△CT of RTPCR were respectively 1.00±0.72，1.08±0.49，0.97±0.41（P＞0.05），the PHB protein of Western blot were respectively 0.33± 0.21、0.59±0.25、1.72±0.96（P＜0.05）.Conclusions PHB mRNA relative have no obvious changes among three groups，but PHB expression quantity is significantly higher than nasopharyngeal mucosa patients in patients with NPC，and lower than familial NPC patients.It`s concern about PHB expression regulation the role in the Ras-driven activation of PI3K/Akt and Raf-1/ERK signaling cascades，PHB can be regarded as a biomarker of NPC.

familial nasopharyngeal carcinoma；Prohibitin；biomarker；Qi deficiency

陳舒華，主任醫(yī)師.Email:cshua11@iCloud.com

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.02.002

*資金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173310，30572408），佛山市重點(diǎn)?？婆嘤?xiàng)目建設(shè)資助（Fspy2-2015008），佛山市創(chuàng)新型城市建設(shè)科技項(xiàng)目（2013AG10012）