靳繼偉　王迎寒　張曉峰　杜海燕　郭洪杰

(承德醫(yī)學(xué)院,河北　承德　067000)

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健脾化濕顆粒對腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸5-羥色胺、5-羥色胺3受體的影響

靳繼偉王迎寒張曉峰杜海燕郭洪杰

(承德醫(yī)學(xué)院,河北承德067000)

目的探討健脾化濕顆粒對腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)模型大鼠結(jié)腸中5-羥色胺(5-HT)和5-羥色胺3受體(5-HT3R)水平的影響。方法選用60只SD雄性大鼠，按體重隨機(jī)分成六組，分別為正常組，模型組，健脾化濕顆粒低、中、高劑量組，陽性對照組。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠結(jié)腸黏膜中5-HT含量，采用免疫組化法檢測結(jié)腸黏膜下5-HT3R陽性細(xì)胞的表達(dá)量，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測結(jié)腸中5-HT3R mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果與正常組相比，模型組結(jié)腸中5-HT水平顯著升高(P<0.05)，結(jié)腸黏膜下層5-HT3R陽性細(xì)胞的含量明顯升高(P<0.05)，結(jié)腸中5-HT3R mRNA的表達(dá)水平亦顯著升高(P<0.05)；健脾化濕顆?？梢越档?-HT水平，5-HT3R水平及其mRNA表達(dá)量。結(jié)論健脾化濕顆?？赡芡ㄟ^降低結(jié)腸黏膜5-HT含量，減少結(jié)腸5-HT3R的表達(dá)量，減弱5-HT3R神經(jīng)元興奮性，從而改善內(nèi)臟痛覺敏感狀態(tài)，消除腸道反應(yīng)。

腹瀉型腸易激綜合征;5-羥色胺;5-羥色胺3受體

腸易激綜合征(IBS)是一種常見的胃腸道功能紊亂性疾病，常常表現(xiàn)為腹痛、腹脹、排便和大便性狀異常，預(yù)后良好不危及生命，但是長期反復(fù)發(fā)作可以明顯降低患者的生活質(zhì)量。目前認(rèn)為IBS的發(fā)病機(jī)制主要是內(nèi)臟高敏感和胃腸動力異?！?〕。根據(jù)糞便性狀，IBS可以分為腹瀉型、便秘型、腹瀉-便秘交替型〔2〕。腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)患者以腹痛、腹瀉為主，并同時(shí)伴有心煩、抑郁、焦慮等神經(jīng)功能失調(diào)癥狀，是臨床上常見的胃腸道功能性疾病。本實(shí)驗(yàn)通過檢測結(jié)腸5-羥色胺(5-HT)及5-HT3受體(5-HT3R)的含量變化探討健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠5-HT信號系統(tǒng)的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動物由北京華阜康生物科技股份有限公司提供的同批無特定病原體(SPF)清潔級雄性SD大鼠60只，體重為(250±10)g。

1.2藥品番瀉葉(安國市昌達(dá)中藥材飲片有限公司，批號1009002)，用水煎煮 2次后濃縮為含生藥量0.3 g/ml的藥液；陽性對照藥為得舒特(法國蘇維特公司，批號627414)，用蒸餾水配制成為3 mg/ml的溶液；健脾化濕顆粒，由炙黃芪、益智仁、炒白術(shù)等共10味中藥制成。

1.3儀器試劑SORVALL Biofuge fresco冷凍離心機(jī)(德國Kendro Labrotary公司)；DU800紫外可見分光光度計(jì)(美國CKMAN COULTER公司)；美國Biorad icycler PCR儀(icycler)；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)；5-HT酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；TaKaRa RNA PCR Kit(大連寶生物工程有限公司)；引物合成(上海英濰捷基貿(mào)易有限公司)；各引物序列：β-actin正義鏈5'-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，反義鏈5'-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3'，長度452 bp；5-HT3R正義鏈5'-ATCAATGAGTTTGTGGACGTGG-3'，5-HT3R反義鏈5'-GCGGATGACCACGTAGAACT-3'，354 bp。DNA Marker(北京天根生化科技有限公司)；SP免疫組織化學(xué)試劑盒(北京四正柏生物技術(shù)有限公司)；

1.4分組與造模方法將60只SD雄性大鼠按照體重隨機(jī)分成六組，分別為正常組、模型組、陽性對照組、健脾化濕顆粒低、中、高劑量組，每組10只。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水，除正常組外其余各組大鼠前2 w分別予以番瀉葉煎劑灌胃。后2 w在灌服完番瀉葉煎劑后用透明膠帶束縛大鼠前上肢，胸部及肩部持續(xù)2 h。2 h后模型組予以生理鹽水灌胃；健脾化濕顆粒低、中、高劑量組予以健脾化濕顆粒0.25、0.5、1 g/ml劑量灌胃；陽性對照組予以得舒特(3 mg/ml)灌胃；正常組全程只予以生理鹽水灌胃，以上灌胃劑量均按10 ml/kg。末次給藥后處死大鼠，取距離肛門處約5～6 cm結(jié)腸，用生理鹽水清洗干凈，之后一部分置于-80℃冰箱里冷凍保存，用于酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)；一部分多聚甲醛固定用于免疫組化。

1.5ELISA檢測大鼠結(jié)腸中5-HT含量取儲存于-80℃冰箱結(jié)腸，用ELISA法測定結(jié)腸中5-HT水平。操作步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6免疫組化法檢測結(jié)腸黏膜下層5-HT3R陽性細(xì)胞表達(dá)量取經(jīng)過多聚甲醛固定的結(jié)腸組織，石蠟包埋后切片進(jìn)行免疫組化染色實(shí)驗(yàn)。操作步驟嚴(yán)格按照SP免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行，應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，其中以磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對照。以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)物視為陽性反應(yīng)，陰性對照組無棕黃色反應(yīng)物。采用IPP圖像分析軟件對5-HT3R的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。每例隨機(jī)選取 6個(gè)400×視野的平均光密度值作為測量值，其值越大則染色越強(qiáng)。

1.7RT-PCR法檢測大鼠結(jié)腸中5-HT3R mRNA水平取儲存于-80℃冰箱中結(jié)腸組織，用于提取RNA。①采用Trizol一步法從大鼠結(jié)腸中提取總RNA，加入無酶水充分溶解。②將上述稀釋適當(dāng)倍數(shù)后的RNA經(jīng)DU800紫外可見分光光度計(jì)測出稀釋后的RNA濃度，再計(jì)算出RNA總濃度cRNA。③按照總RNA上樣量為2 μg配制成20 μl體系充分混勻，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。④在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增,以β-actin作為內(nèi)參照。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析中的LSD檢驗(yàn)及Dunnettt檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸5-HT的影響與正常組相比，模型組5-HT水平明顯升高〔(1.9±0.2)vs(0.9±0.1)ng/ml，P<0.05〕；與模型組比較，健脾化濕顆粒低〔(1.7±0.1)ng/ml〕、中〔(1.3±0.2)ng/ml〕、高劑量組〔(1.1±0.1)ng/ml〕以及陽性對照組5-HT水平均降低〔(1.5±0.2)ng/ml，P<0.05〕；與陽性對照組比較，健脾化濕顆粒低劑量組5-HT水平升高(P<0.05)。健脾化濕顆粒中、高劑量組5-HT水平降低，其中健脾化濕顆粒高劑量組5-HT水平降低作用最為顯著(P<0.05)。

2.2健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸黏膜下層5-HT3R陽性表達(dá)的影響與正常組比較，模型組5-HT3R陽性表達(dá)水平明顯增多(0.264±0.013 vs 0.126±0.010,P<0.05)。與模型組比較，健脾化濕顆粒低、中、高劑量組(0.226±0.013、0.170±0.008、0.137±0.008)以及陽性對照組5-HT3R陽性表達(dá)水平均降低〔(0.178±0.014)，P<0.05〕；與陽性對照組比較，健脾化濕顆粒低劑量組5-HT3R陽性表達(dá)水平升高(P<0.05)；健脾化濕顆粒中劑量組與之作用相似(P>0.05)；健脾化濕顆粒高劑量組5-HT3R陽性表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。見圖1。

2.3健脾化濕顆粒對D-IBS大鼠結(jié)腸5-HT3R mRNA表達(dá)水平的影響見圖2。與正常組比較，模型組5-HT3R mRNA水平明顯升高(0.736±0.063 vs 0.254±0.041,P<0.05)。與模型組比較，健脾化濕顆粒中、高劑量組5-HT3R mRNA水平降低(0.549±0.078，0.355±0.022，P<0.05)，健脾化濕顆粒低劑量組5-HT3R mRNA水平無明顯變化(0.695±0.068，P>0.05)；與陽性對照組(0.627±0.049)比較，健脾化濕顆粒高劑量組5-HT3R mRNA水平明顯降低(P<0.05)。

圖1　健脾化濕顆粒對大鼠結(jié)腸黏膜5-HT3R表達(dá)的影響(DAB，×400)

1～6：正常組，模型組，陽性對照組，健脾化濕顆粒低、中、高劑量組圖2　健脾化濕顆粒對大鼠結(jié)腸5-HT3R mRNA表達(dá)水平的影響

3　討　論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為IBS發(fā)病原因可能與基因、感染、腸黏膜屏障功能紊亂、腦腸軸功能異常等多種因素有關(guān)，近年來隨著精神胃腸疾病學(xué)的發(fā)展，認(rèn)為腦-腸軸功能紊亂是導(dǎo)致IBS的主要病機(jī)之一，5-HT作為重要的腦腸神經(jīng)遞質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能,參與了胃腸運(yùn)動，攝食、睡眠、情緒、認(rèn)知等多種生理功能的調(diào)控。在生理狀態(tài)下，腸嗜鉻(EC)細(xì)胞能自發(fā)的向固有層和腸腔內(nèi)釋放一定量的5-HT，而各種腸道刺激均能通過刺激EC細(xì)胞釋放大量額外的5-HT,有學(xué)者曾提出EC細(xì)胞分泌的5-HT與神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道感覺運(yùn)動〔3〕存在不同程度的相關(guān)性。有研究〔4〕顯示D-IBS患者的5-HT釋放量增加,通過對D-IBS患者血液中5-HT濃度的測定發(fā)現(xiàn)其明顯高于對照組。推測5-HT釋放量增加與IBS密切相關(guān)的原因可能是：一方面可能導(dǎo)致內(nèi)臟傳入神經(jīng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)的敏感性增高，激活多種有關(guān)的神經(jīng)活性物質(zhì)，使其參與腦-腸調(diào)節(jié)的化學(xué)信號異常；另一方面 5-HT 與腸黏膜上皮、黏膜下或肌間神經(jīng)叢的 5-HT 受體相結(jié)合，在胃腸道運(yùn)動、內(nèi)臟高敏感等方面發(fā)揮著重要作用。5-HT受體比較復(fù)雜，目前已知5-HT受體分為7個(gè)家族即5-HT1-7R，14個(gè)亞型〔5〕，主要分為兩大類，分別是配體門控離子通道受體和G蛋白耦聯(lián)受體。其中5-HT3R和5-HT4R與胃腸道感覺和運(yùn)動最為密切。5-HT通過與5-HT受體結(jié)合調(diào)節(jié)分泌、吸收、胃腸運(yùn)動及感覺等復(fù)雜功能，形成一系列排便異常等IBS典型癥狀。其中5-HT3R是唯一的一種非G蛋白耦聯(lián)受體，在黏膜下神經(jīng)叢和腸肌間神經(jīng)叢均有表達(dá)。5-HT3R激活后可以產(chǎn)生一系列效應(yīng)，包括細(xì)胞膜去極化以及增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，使中樞和外周神經(jīng)元興奮，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,進(jìn)一步使副交感神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿(Ach)增多，從而導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感性和腹部不適等胃腸道功能異常。研究表明5-HT3R在D-IBS模型中的表達(dá)明顯高于空白對照組〔3〕。此過程可被5-HT3受體拮抗劑所抑制，此機(jī)制可能通過增加腸道順應(yīng)性，提高其痛閾水平并增加小腸對水、電解質(zhì)的吸收而達(dá)到有效緩解腹脹、腹痛、便急等癥狀。5-HT3受體調(diào)節(jié)劑主要是5-HT3受體拮抗劑，多應(yīng)用于D-IBS，代表性藥物包括昂丹司瓊、阿洛司瓊等。 綜上所述，5-HT作為重要的神經(jīng)遞質(zhì)和信號分子，在參與和調(diào)節(jié)胃腸道功能中通過自身調(diào)節(jié)或與多種受體作用參與了IBS胃腸動力異常和內(nèi)臟高敏感性，5-HT信號系統(tǒng)在IBS發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。

中醫(yī)學(xué)理論依據(jù)臨床表現(xiàn)將D-IBS歸屬于“腹痛”、“泄瀉”范疇，認(rèn)為本病的病機(jī)為肝郁脾虛，脾臟在損傷的情況下，易為情志所傷導(dǎo)致肝木乘脾，可使脾氣健運(yùn)，氣機(jī)升降失常，導(dǎo)致本病發(fā)生。健脾化濕湯源于上海著名中醫(yī)馬貴同教授的經(jīng)驗(yàn)方，已有三十多年的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，共有10味藥組成，方中炙黃芪益脾氣、升清陽，益智仁溫補(bǔ)脾腎、固澀止瀉，二者共為君藥。炒白術(shù)、茯苓助黃芪健脾益氣，兼能化濕，為健脾培土之重臣；砂仁化濕行氣、溫中止瀉，烏藥溫腎散寒、行氣止痛，既助益智仁溫腎止瀉，又通暢濕邪所阻之氣機(jī)；四者為臣藥。陳皮理氣燥濕，炒白芍柔肝調(diào)氣，防風(fēng)香燥勝濕，炙甘草健脾益氣，調(diào)和諸藥，四者共為佐使。諸藥配合緊密，共奏理氣健脾、化濕止瀉之奇效，適用于D-IBS。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，建模成功后大鼠明顯出現(xiàn)腹瀉，急躁易怒，體重降低，大鼠腸道指數(shù)變化率增加，內(nèi)臟敏感性降低等癥狀，與臨床中D-IBS患者癥狀極其相似,健脾化濕顆?？梢愿纳艱-IBS大鼠此等癥狀，其作用機(jī)制可能與降低中樞5-HT水平有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示健脾化濕顆?？赡芡ㄟ^降低大鼠結(jié)腸黏膜5-HT和5-HT3R水平進(jìn)而減弱神經(jīng)元興奮性，升高內(nèi)臟痛閾水平，從而消除腸道反應(yīng)。然而D-IBS發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，無法用單一的生理病理知識解釋其復(fù)雜的癥狀，同樣健脾化濕顆粒在改善D-IBS癥狀的作用機(jī)制也不是單一的，在今后的研究中尚需從多個(gè)角度進(jìn)一步探討健脾化濕顆粒在治療D-IBS中的作用機(jī)制。

1Kanazawa M,Hongo M,Fukudo S.Visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome〔J〕.J Gastroenterol Hepatol,2011;26(Suppl 3):119-21.

2Moore NA,Sargent BJ,Manning DD,etal.Partial agonism of 5-HT3 receptors:a novel approach to the symptomatic treatment of IBS-D〔J〕.ACS Chem Neurosci，2013;4(1):43-7.

3Gershon MD,Tack J.The serotonin signaling system:from basic understanding to drug development for functional GI disorders〔J〕.Gastroenterology,2007;132(1):397-414.

4Cremon C,Carini G,Wang B,etal.Intestinal serotonin release,sensory neuron activation,and abdominal pain in irritable bowel syndrome〔J〕.Am J Gastroenterol,2011;106(7):1290.

5Chiba T,Yamamoto K,Sato S,etal.Long-term efficacy and safety of ramosetron in the treatment of diarrhea-predominant irritable bowel syndrome〔J〕.Clin Exp Gastroenterol,2013;6:123-8.

〔2014-12-09修回〕

(編輯馮超/曹夢園)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.004

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.10276105D-45)

郭洪杰(1962-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事中醫(yī)內(nèi)科學(xué)研究。

靳繼偉(1990-)，女，碩士，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

R442.2

A

1005-9202(2016)14-3357-03；