楊小淮　周　誠(chéng)　潘治宇　楊麗娟　李正紅

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽　蚌埠　233030)

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內(nèi)嗎啡肽-1對(duì)高糖環(huán)境下樹(shù)突細(xì)胞免疫功能的影響

楊小淮1周誠(chéng)潘治宇楊麗娟李正紅

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽蚌埠233030)

目的觀察內(nèi)嗎啡肽(EM)-1對(duì)高糖環(huán)境下樹(shù)突細(xì)胞(DC)免疫功能的影響。方法從正常人外周血中提取和分離單個(gè)核細(xì)胞，誘導(dǎo)成為未成熟DC；使用高濃度葡萄糖作為刺激因素，不同濃度的EM-1作為干預(yù)因素；分別設(shè)高糖組(HG組)、高糖加10-6mmol/L EM-1組(A組)、高糖加10-8mmol/L EM-1組(B組)、高糖加10-10mmol/L EM-1組(C組)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表型變化；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)DC分泌的細(xì)胞因子的變化；DC與自體淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果與HG組比較，A組CD83、CD86、趨化因子受體(CCR)7和CD36表達(dá)均上調(diào)，B組和C組CD86、CCR7和CD36表達(dá)上調(diào)；與HG組比較，A組、B組和C組白細(xì)胞介素(IL)-12和IL-10的分泌均減少，T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)均降低，以A組作用明顯。結(jié)論EM-1上調(diào)高糖環(huán)境下DC表面分子CD83、CD86、CCR7和CD36表達(dá)，抑制DC分泌炎性細(xì)胞因子IL-12和IL-10，抑制DC的T淋巴細(xì)胞增殖能力。

樹(shù)突細(xì)胞；高糖；內(nèi)嗎啡肽-1；動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病，免疫和炎癥是致其發(fā)病和發(fā)展的關(guān)鍵〔1,2〕。AS是糖尿病(DM)最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，其發(fā)生的機(jī)制尚未完全清楚，而高血糖作為DM患者體內(nèi)最具有特征性的改變，在DM血管并發(fā)癥中起著始動(dòng)和關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔3,4〕。樹(shù)突細(xì)胞(DC)是目前已知功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，最大特點(diǎn)是能刺激初始型T淋巴細(xì)胞活化和增殖，而其他的抗原遞呈細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞僅能刺激已活化的T淋巴細(xì)胞或記憶T淋巴細(xì)胞，因此DC是特異性免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，其激活T淋巴細(xì)胞能力也是巨噬細(xì)胞1 000倍。研究表明，DC參與了AS發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程，在激活和放大AS的炎癥免疫反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用〔1〕。高糖可以促進(jìn)DC成熟和激活T淋巴細(xì)胞的能力，并通過(guò)自身釋放一些炎癥因子，加速和放大炎癥免疫反應(yīng)〔5〕。內(nèi)嗎啡肽(EM)-1是1997年新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性阿片肽，被認(rèn)為是Mu阿片受體(MOR)的內(nèi)源性配體〔6〕，具有廣泛的生物學(xué)作用，如鎮(zhèn)痛、心血管效應(yīng)和免疫應(yīng)答等。最新研究發(fā)現(xiàn)EM-1能抑制巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)，下調(diào)單核-巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞表面CD36的表達(dá)，影響腫瘤壞死因子(TNF)-α 和干擾素(IFN)-γ的釋放，而影響動(dòng)脈斑塊的形成，可能具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用〔7〕。那么EM是否能通過(guò)影響DC的分化成熟和免疫功能，而參與AS的形成和發(fā)展，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察EM-1對(duì)高糖環(huán)境下人DC的成熟和免疫功能的影響，以探討EM可能對(duì)AS發(fā)生發(fā)展的影響。

1　材料和方法

1.1藥品與試劑淋巴細(xì)胞分離液(天津TBD生物技術(shù)公司)；無(wú)糖型RPMI1640溶液(杭州吉諾公司)；EM-1和D-葡萄糖(SIGMA公司)；抗體：CD83-FITC和CD86-PE(Invitrogen公司)，CD36-FITC、HLA DR-PERCP和CD11c-APC(eBioscience公司)，CD3-APC(天津協(xié)科生物公司)；人白細(xì)胞介素(rhIL)-10 和rhIL-12酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(R&D公司)。

1.2標(biāo)本來(lái)源用于DC培養(yǎng)的健康人外周血取自本院學(xué)生志愿者，年齡18～22(平均20)歲。均排除心臟病或DM史。

1.3DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)Ficoll 密度梯度離心法分離正常人外周血得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用RPMI1640洗滌2 次，用RPMI1640 完全培養(yǎng)基(含10%滅活新生牛血清)調(diào)節(jié)PBMC 密度至1×107cell/ml，加入6孔板中，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，洗去非貼壁細(xì)胞即淋巴細(xì)胞，凍存淋巴細(xì)胞。貼壁細(xì)胞用含人粒-單集落刺激因子(rhGM-CSF)、rhIL-4的無(wú)糖RPMI1640 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；每隔2 d半量換液，補(bǔ)充等量細(xì)胞因子；第7天收獲未成熟DC(imDC)。

1.4高糖環(huán)境下DC的分組誘導(dǎo)培養(yǎng)用無(wú)糖RPMI1640完全培養(yǎng)基定濃收集的imDC，按照每孔1×106cell/ml的濃度種進(jìn)24孔板，每孔加入相同濃度的D-葡萄糖(終濃度為25 mmol/L)和不同濃度的EM-1(HG組、A組、B組、C組的EM-1濃度分別為0、10-6、10-8、10-10mmol/L)，放置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 d。分別收集上清液500 μl，凍存。

1.5鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和流式檢測(cè)DC表面分子在鏡下觀察各組細(xì)胞后，分別收集各組細(xì)胞，離心定容后移至流式上樣管，并用CD83-FITC、CD86-PE、CD36-FITC和CCR7-PE熒光標(biāo)記抗體染色，混勻后避光室溫染色30 min，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，2%含多聚甲醛(PFA)200 μl重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并用Cellquest軟件和Flow Jo軟件分析。

1.6檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖復(fù)蘇凍存的同體淋巴細(xì)胞，用無(wú)糖不完全RPMI1640重懸細(xì)胞并調(diào)節(jié)濃度為106個(gè)/ml。加入羧基熒光素二蠟酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)貯存液(終濃度為1 μmol/L)，置37℃水浴箱染色15 min，用無(wú)糖完全RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次。取出少部分CFSE染色后的淋巴細(xì)胞標(biāo)記的抗CD3-APC抗體作為原代細(xì)胞，置于4℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆?。收集各組DC細(xì)胞，用PBS洗滌3次，洗凈高糖和EM-1。每組按照5 000個(gè)DC和106個(gè)標(biāo)記CFSE的淋巴細(xì)胞混合加入96孔板中，放置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 d。分別吸出各組全部細(xì)胞，用PBS洗滌3次后，移至流式上樣管，并用抗CD3-APC抗體染色，混勻后避光室溫染色30 min，經(jīng)PBS洗滌2次，2% PFA 200 μl重懸后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用Flow Jo軟件分析得出各組的DC刺激T淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)(PI)。

1.7ELISA法檢測(cè)DC分泌細(xì)胞因子IL-10和IL-12的含量解凍各組DC上清液，離心10 min除去顆粒和聚合物，按照ELISA試劑盒中說(shuō)明書(shū)的步驟測(cè)定。繪制擬合曲線，R2>0.99，保證了由該曲線及其方程求出的樣本濃度具有很強(qiáng)的可信性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、q檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1高糖環(huán)境下EM-1對(duì)DC形態(tài)學(xué)的影響在葡萄糖濃度為25 mmol/ml環(huán)境下，第9天DC的形態(tài)并沒(méi)因EM-1的干預(yù)發(fā)生明顯改變。見(jiàn)圖 1。

2.2高糖環(huán)境下EM-1誘導(dǎo)DC表型的變化見(jiàn)表1。與HG組相比，A組CD83、CD86、CCR7和CD36表達(dá)均上調(diào)，B組和C組CD86、CCR7和CD36表達(dá)上調(diào)。

圖1　高糖環(huán)境下不同濃度EM-1誘導(dǎo)DC的形態(tài)學(xué)變化(×200)

組別CD83CD86CCR7CD36HG組29.56±1.5349.15±2.9528.40±1.2528.25±2.19A組33.78±2.851)58.21±1.272)43.36±3.932)42.02±1.8320)B組29.53±0.993)56.12±0.692)37.24±1.712)3)34.72±1.212)4)C組31.51±3.0255.21±1.692)32.61±1.511)4)5)30.81±1.064)5)F/P值4.0/<0.0522.18/<0.0137.08/<0.0167.13/<0.01

與HG組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與A組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與B組比較：5)P<0.01

2.3高糖環(huán)境下EM-1誘導(dǎo)DC與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后的T淋巴細(xì)胞增殖情況變化HG組PI值最高(2.13±0.02)，明顯高于原代(1.21±0.01)，說(shuō)明高糖作用下的DC能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖；3組不同濃度的EM-1干預(yù)后的T淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)分別是A組(1.56±0.04)、B組(1.98±0.03)、C組(1.96±0.03)，均顯著低于HG組(P<0.01)，高濃度A組EM-1作用顯著高于B組和C組(P<0.01)。

2.4高糖環(huán)境下EM-1誘導(dǎo)DC分泌IL-10和IL-12的變化EM-1能顯著抑制高糖環(huán)境下DC炎性因子IL-12和IL-10的分泌。見(jiàn)表2。

表2　高糖環(huán)境下EM-1誘導(dǎo)DC分泌的IL-10和IL-12含量

與HG組比較：1)P<0.01；與A組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；與B組比較：4)P<0.01

3　討　論

2型糖尿病(T2DM)致死致殘的重要原因之一就是AS〔8〕，AS是一種與脂質(zhì)在動(dòng)脈壁聚集相關(guān)和各種炎性細(xì)胞參與的慢性炎癥過(guò)程，其基本病變是動(dòng)脈內(nèi)膜的脂質(zhì)沉積、內(nèi)膜灶狀纖維化、粥樣斑塊形成。文獻(xiàn)〔9〕報(bào)道DC在人AS病變中的數(shù)量明顯增加，而且在炎性浸潤(rùn)區(qū)域聚集。其中一部分DC吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞；另一部分DC以成熟形式為主，呈遞抗原激活和促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，并與巨噬細(xì)胞和活化的T淋巴細(xì)胞聚集一起形成斑塊，在不穩(wěn)定斑塊中DC數(shù)量更是增多明顯，并參與斑塊破裂的發(fā)生。

CD36是清道夫受體B家族的一員，主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、DC、血小板和脂肪細(xì)胞等。CD36與氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)識(shí)別、攝取和泡沫細(xì)胞的形成及血管病損處炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，是AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中非要重要的受體〔10,11〕。EMs是生物體內(nèi)產(chǎn)生天然的具有阿片樣活性的物質(zhì)，文獻(xiàn)〔12,13〕報(bào)道EMs能通過(guò)與免疫細(xì)胞表面的MOR結(jié)合，影響一些炎性細(xì)胞的免疫功能，達(dá)到抑制炎癥的作用。EMs還可以保護(hù)高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損害〔14〕，通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞其表面分子CD36的表達(dá)和TNF-α與IFN-γ的釋放，影響動(dòng)脈斑塊的形成〔7〕。

已有文獻(xiàn)〔5〕報(bào)道，高糖可以促進(jìn)DC成熟、上調(diào)CD86等表型的表達(dá)和加強(qiáng)DC激活T淋巴細(xì)胞的能力，并通過(guò)自身釋放一些炎癥因子，加速和放大炎癥免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)AS的形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示EM-1可能進(jìn)一步活化DC，促進(jìn)其趨向成熟、加速其遷移活動(dòng)，增強(qiáng)DC的炎癥免疫反應(yīng)；EM-1加強(qiáng)DC吞噬脂質(zhì)能力，參與AS的形成；EM-1抑制DC釋放炎性因子IL-10和IL-12，并抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，可能具有抗炎和抑制動(dòng)脈斑塊形成的作用。EM-1對(duì)DC免疫功能影響的復(fù)雜性，有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-07-25修回〕

(編輯馮超/王一涵)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.009

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2011A202)；蚌埠醫(yī)學(xué)院科技發(fā)展基金重點(diǎn)項(xiàng)目(Bykf13A10)

李正紅(1970-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事免疫性疾病研究。

楊小淮(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事慢性炎癥研究。

R587.1

A

1005-9202(2016)14-3370-03；

1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科