張鋒

（寶雞文理學院 化學化工學院，陜西省植物化學重點實驗室，陜西 寶雞 721013）

油田化學

基于培養(yǎng)基優(yōu)化和保護劑篩選的直投式酸奶發(fā)酵劑的研制*

張鋒

（寶雞文理學院 化學化工學院，陜西省植物化學重點實驗室，陜西 寶雞 721013）

利用正交試驗確定了嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化，冷凍保護劑篩選實驗的最佳條件。添加1.0%番茄汁+0.3%玉米漿+2.0%乳糖的優(yōu)化培養(yǎng)基具備良好生理特性，谷氨酸鈉與脫脂乳對菌種活性在冷凍過程中有明顯保護作用。在優(yōu)化工藝下，凍干后活菌數(shù)分別達到4.3×1011cfu·g-1和4.2×1011cfu·g-1；凍干粉復(fù)配成直投式發(fā)酵劑后具有良好的發(fā)酵特性，完全符合發(fā)酵高粘度酸奶用直投式發(fā)酵劑的要求。

凍干粉；直投式發(fā)酵劑；酸奶發(fā)酵

發(fā)酵酸奶由于其具有豐富的營養(yǎng)價值和良好的保健功能，國內(nèi)消費者對酸奶的認識逐步提高，其產(chǎn)銷量亦呈迅猛增長之勢。目前，我國發(fā)酵酸奶的生產(chǎn)過程中，一般采用繼代式酸奶菌種和直投式酸奶發(fā)酵劑（Direct-to-vat cultures，簡稱DVS）。繼代式酸奶菌種方便、價廉，使得大小生產(chǎn)廠家均可自行調(diào)制，極大地擴充了酸奶生產(chǎn)領(lǐng)域，但在酸奶生產(chǎn)的進一步集約化、規(guī)模化發(fā)展中，繼代式酸奶菌種的多次活化和擴培的煩瑣工藝越來越不能滿足要求［1］。直投式酸奶發(fā)酵劑不需要經(jīng)過活化、擴增而直接應(yīng)用于生產(chǎn)，郵寄儲藏方便、保質(zhì)期長，接種量少，使得每批發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，也防止了菌種的退化和污染，大大提高了發(fā)酵酸奶制品工業(yè)的勞動生產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量。因此，近年來越來越多的酸奶生產(chǎn)公司選擇直投式酸奶發(fā)酵劑用于生產(chǎn)［2］。

為了得到高活菌數(shù)并且具有良好發(fā)酵性能的發(fā)酵劑，本文從培養(yǎng)基優(yōu)化、冷凍干燥保護劑篩選關(guān)鍵技術(shù)方面入手，研究了適合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長的培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間，確定最佳的培養(yǎng)條件，并配制成具有良好發(fā)酵特性的直投式酸奶發(fā)酵劑。旨在生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)廉價、發(fā)酵特性與國外同類產(chǎn)品相近的直投式酸奶發(fā)酵劑，并優(yōu)化其工業(yè)化生產(chǎn)工藝。

1　實驗部分

1.1菌種

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus GF，文中以 GF表示） 嗜熱鏈球菌（Streptococcus. thermophilus BF，文中以BF表示）由寶雞圣豐乳業(yè)有限責任公司鑒定并提供。

1.2pH值測定

采用PHS-3C型酸度計。

1.3酸度測定［3］

在無菌條件下取出10mL酸奶于50mL小燒杯中，加入20mL蒸餾水，混勻后在其中加入1～3D酚酞試劑，用0.100mol·L-1NaOH標準溶液滴定至樣品呈粉紅色且30s不退去，讀出所用的NaOH的體積數(shù)，再乘以10，則此數(shù)值即為樣品的滴定酸度，以吉爾涅度（oT）表示。

1.4生長曲線測定

為了得到GF和BF的生長規(guī)律，按2%的接種量將GF和BF分別接種到其發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)，每隔一段時間取樣測OD和pH值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標作圖，得出生長曲線。

1.5OD值測定

Cary-50型分光光度計在600nm波長下測定，當OD超過0.7時作稀釋，控制稀釋倍數(shù)，使測得的OD值在0.4～0.7范圍內(nèi)，實際測得的OD值乘以稀釋倍數(shù)就是所得的OD值。

1.6菌落計數(shù)

BF和GF計數(shù)都采用傾注平板法計數(shù)，以MRS固體培養(yǎng)基，在37℃下厭氧恒溫培養(yǎng)48～72h，使用Scan100菌落計數(shù)器計數(shù)。

1.7培養(yǎng)基優(yōu)化

以MRS培養(yǎng)基［4］為基礎(chǔ)，參考部分文獻研究結(jié)果，選取番茄汁、玉米漿、乳糖作為促生長因子，設(shè)計正交試驗因素，具體方案見表1，在最佳培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，活菌計數(shù)。

表1　培養(yǎng)基優(yōu)化實驗方案Tab.1　Experiment scheme of medium optimization

1.8保護劑篩選

取離心后收集的菌體0.5mL沉淀并作活菌計數(shù)，作為對照，同時對加入不同保護劑的菌種并經(jīng)過預(yù)凍和真空冷凍干燥的菌體測定活菌數(shù)，計算存活率，篩選最優(yōu)保護劑。不同保護劑正交實驗方案見表2。

表2　保護劑篩選實驗方案Tab.2　Experiment scheme of protective agent screening

1.9酸奶發(fā)酵

11.5%全脂奶粉和6%的蔗糖，完全按酸奶生產(chǎn)工藝溶解均質(zhì)滅菌后，接種，在43℃恒溫發(fā)酵。

2　結(jié)果與討論

2.1培養(yǎng)基優(yōu)化實驗

表3　GF/BF培養(yǎng)基成分優(yōu)化正交實驗結(jié)果Tab.3　Orthogonal experiment results of the GF/BF culture medium composition optimization

由表3得出，對菌落數(shù)目影響因素的大小順序為番茄汁＞玉米漿＞乳糖。由活菌數(shù)結(jié)果結(jié)果可知，優(yōu)化最佳培養(yǎng)基成分為番茄汁1.0%+玉米漿0.3%+乳糖2.0%。在最優(yōu)培養(yǎng)基條件下，重復(fù)進行了兩次驗證試驗，活菌計數(shù)平均為1.58×109cfu· mL-1，與表1數(shù)據(jù)相似。張?zhí)m威［5］等將脫脂乳分別與番茄汁和啤酒混合進行培養(yǎng)基優(yōu)化，對菌落數(shù)增值起到了明顯促進作用。啤酒中含有豐富的氨基酸、維生素等酵母代謝必需物，有利于GF和BF增殖。但隨著啤酒含量超過5%，反而對細菌生長出現(xiàn)較為明顯的抑制作用，這可能與酒精對細菌的作用有關(guān)。而單純添加番茄汁則可能會影響培養(yǎng)基pH值，進而抑制BF增殖。劉丹［6］等則通過碳氮源及緩沖鹽篩選提高了菌種培養(yǎng)效果。而報道的專利［7］和文獻［8］則通過添加超濾濃縮乳或蛋白胨作為輔助營養(yǎng)成分來使菌落增值，菌數(shù)可達108cfu·mL-1，但不足之處在于培養(yǎng)基成本較高。而本研究的增殖培養(yǎng)基也能達到相同數(shù)量級的細菌增殖效果，相比較之下成本較低。

2.2保護劑篩選實驗

表4　保護劑篩選正交實驗結(jié)果Tab.4　Orthogonal experiment results of protective agent screening

由表4直觀分析得出，對活菌凍干后存活影響因素谷氨酸鈉＞脫脂乳＞海藻糖＞甘油＞吐溫80。KILARA A等將麥芽提取液、煉乳、乳清用于菌種冷凍干燥的保護劑，均得到了較好的效果。GRACIELA等則將多元醇引入添加脫脂乳的保護體系，結(jié)果證明聚乙二醇、甘油、果膠等多羥基物質(zhì)均能起到保護菌種活性的作用。這與該類物質(zhì)物質(zhì)與菌種蛋白形成氫鍵，從而保證其在冷凍過程中結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)。而谷氨酸鈉、吐溫80作為常規(guī)的冷凍干燥保護劑，在相關(guān)文獻中均有涉及［9］。但是不同保護劑對菌株的保護作用，只有對其進行合理搭配才能起到最佳保護效果。如表4數(shù)據(jù)所示，上述保護劑之間存在一定程度相互抑制作用，同時添加不利于達到最佳保護效果，按照影響因素大小優(yōu)先考慮谷氨酸鈉與脫脂乳作為冷凍保護劑。

2.3最佳生長曲線

將經(jīng)過活化的GF和BF，按2%的接種量接入優(yōu)化培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)，每隔一定時間取樣分別測定發(fā)酵液OD值、pH值，得到GF和BF的生長曲線。

圖1　GF和BF生長時的OD變化情況Fig.1　OD changes in GF and BF growth

從圖1可以看出，GF和BF的發(fā)酵曲線十分相似。在0～4h時兩株菌的OD都沒多大變化，菌體生長處與延滯期。4～12hOD值迅速上升處在菌體生長的對數(shù)生長期，12h后OD增加趨緩，進入菌體生長的穩(wěn)定期。

圖2　GF和BF生長時pH值變化情況Fig.2　pH changes in GF and BF growth

從圖2也可以看出這一趨勢。一般來說，對數(shù)生長期后期和穩(wěn)定期前期的菌種保存活力最高［10］。所以我們選擇12、14h作為菌體培養(yǎng)的收獲期，作凍干試驗。根據(jù)前期試驗，我們選用已經(jīng)成熟的菌體收集工藝、凍干保護劑配方和凍干工藝。兩株菌在培養(yǎng)12、14h后分別離心收集菌體，添加保護劑，凍干，測定活菌數(shù)得到表5的數(shù)據(jù)。

表5　GF和BF在培養(yǎng)12、14h后收集后的凍干情況（1000mL發(fā)酵液）Tab.5　Freeze dry conditions of GF and BF collection after 12 and 14h culture（1000mL fermentation broth）

從表5可以看出，在不同收獲點兩株菌的菌粉得率和活菌數(shù)都有較大差異，GF在培養(yǎng)12和14h后收獲的菌粉分別達到1.12和2.19g·L-1，得率差距比較大，但活菌數(shù)沒有數(shù)量級上的差別。BF在培養(yǎng)12、14h后收獲的菌粉分別達到4.99和4.85g·L-1，菌粉得率差別不大，而且活菌數(shù)差別也不大。

將所得到的GF和BF菌粉添加保護劑后復(fù)配制成直投式發(fā)酵劑，發(fā)酵牛奶，3.5h時已經(jīng)全部凝乳，4h時終止發(fā)酵，測定酸度，放入6℃冰箱后酵。結(jié)果見表6

表6　不同時間段收獲得到的凍干粉配制的發(fā)酵劑的發(fā)酵性能Tab.6　Fermentation capability of Leavening agents prepared by freeze dried powder obtained at different time periods

從表6可以看出，14h收獲的菌體制成發(fā)酵劑后的性能明顯優(yōu)于12h收獲的菌體制成的發(fā)酵劑。而同一時間段收獲的菌體制成的發(fā)酵劑，在菌種比例不同時發(fā)酵性能也不相同。我們選擇14h收獲的菌體來制成菌粉，按活菌數(shù)1∶1比例再添加適量保護劑后配制成發(fā)酵劑。

按上述工藝500L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)菌粉，將菌粉復(fù)配（暫命名為FJJ）后發(fā)酵酸奶，以目前市場上兩家公司的兩款主流發(fā)酵劑做對比，結(jié)果見圖3。

圖3　復(fù)配后發(fā)酵劑的發(fā)酵曲線Fig.3　Fermentation curve of compound fermentation agent

從圖3可以看出，當發(fā)酵到3h時，F(xiàn)JJ與對照2酸度幾乎相同，高于對照1。而當發(fā)酵到4h時，對照1酸度65.970T，對照2酸度74.170T，F(xiàn)JJ的酸度為69.580T，基本達到生產(chǎn)要求。發(fā)酵從4h培養(yǎng)到6h時，對照1和對照2酸度增長明顯，而FJJ酸度增長開始變慢，這從側(cè)面說明該發(fā)酵劑后酸化情況十分理想。但是GF在離心過程中不易分離收集，菌體浪費現(xiàn)象嚴重，為了進一步降低成本需要改進培養(yǎng)和分離工藝。發(fā)酵劑成品在穩(wěn)定性加速試驗中表現(xiàn)優(yōu)秀，但還需穩(wěn)定性長期試驗驗證。

3　結(jié)論

添加1.0%番茄汁+0.3%玉米漿+2.0%乳糖的優(yōu)化培養(yǎng)基具有良好的生理特性，能夠促進GF和BF菌株生長，是最佳增殖培養(yǎng)基，活菌計數(shù)平均為1.58×109cfu·mL-1。冷凍干燥保護劑保護效果谷氨酸鈉＞脫脂乳＞海藻糖＞甘油＞吐溫80，優(yōu)先考慮谷氨酸鈉、脫脂乳作為冷凍保護劑。

在上述優(yōu)化條件下GF和BF菌體在凍干后均達到1011cfu·mL-1以上，且培養(yǎng)14h時收獲的菌體，在制成直投式發(fā)酵劑后具有良好的發(fā)酵特性及后酸化水平，制備得到的酸奶與市售酸奶口感風味較為接近，完全符合直投式發(fā)酵劑的要求，可以滿足酸奶制造商的需要，具備開發(fā)成酸奶發(fā)酵劑的前提。

［1］ 高松柏，黃少磊.雙歧桿菌和雙歧桿菌菌粉的研究［J］.中國乳品工業(yè)，1991，19（2）：51-61.

［2］ 呂兵，張國農(nóng)，肖光輝.新型酸奶發(fā)酵劑的研究［J］.中國乳品工業(yè)，1999，27（5）：9-16.

［3］ 周雪峰.雙歧桿菌與酸奶菌的混合發(fā)酵中菌種配比的研究［J］.淮海工學院學報，2001，10（4）.

［4］ ISO 7889-2003 Yogurt-Enumeration of characteristic microorganisms-Colony-count technique at 37℃.

［5］ 張?zhí)m威，劉維，張書軍.促進混合培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生產(chǎn)物質(zhì)的研究［J］.中國乳品工業(yè)，1999，27（3）：12-15.

［6］ 劉丹，潘道東.直投式乳酸菌發(fā)酵劑增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.食品科學，2005，26（9）：204-207.

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［8］ 張建友，李艷武，趙群波，等.凍干乳酸菌菌種增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.中國乳品工業(yè)，2002，30（5）：14-17.

［9］ 呂燕妮，靳志強，李平蘭，等.酸奶生產(chǎn)用直投式乳酸菌發(fā)酵劑研究［J］.乳品加工，2005，11（2）：47-50.

［10］ 凌代文.乳酸菌細菌分類鑒定及實驗方法［M］北京：中國輕工業(yè)出版社，1999.111-112.

Study on the direct-to-vat culture based on culture medium optimization and protective agent screening*

ZHANG Feng
（Dept.of Chemistry and Chemical Engineering，Baoji University of Arts and Science，Shaanxi Key Laboratory of Phytochemistry，Baoji 721013，China）

In this paper，the optimization experiment condition of culture medium optimizing and cryoprotectants screening was determined for Streptococcus.thermophilus and Lactobacillus bulgaricus by orthogonal experiment.and the best of the.Optimized medium has good physical properties with adding mixture of 1.0%tomato juice，0.3%corn pulp and 2.0%lactose.Sodium glutamate and skimmed milk have obvious protective effects on bacterial activity in the freezing process.In the optimization process，their viable count can separately reach 4.3×1011cfu·g-1and 4.2×1011cfu·g-1in the freeze-dried microbial powder.The Direct-to-vat cultures，consistted of both freezedried microbial powder，had good characteristics in compliance with the high viscosity yogurt fermentation.

Freeze-drying microbial powder；direct-to-vat cultures；yogurt fermentation

TS252.4

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20160718

2016-04-26

陜西省科技廳工業(yè)攻關(guān)項目（2014K08-36）；寶雞市科技局項目（2013R7-4）；陜西省植物化學重點實驗室項目（14JS0 05、12JS008）；寶雞文理學院重點項目（ZK12033）

張鋒（1982-），男，碩士，講師，2010年畢業(yè)于華東理工大學生物化學專業(yè)，主要從事生物催化研究。