徐元成，楊周亮，呂可君（永康市第一人民醫(yī)院，浙江 永康 321300）

胸水細胞塊在鑒別肺腺癌細胞和間皮細胞中抗體的選擇

徐元成，楊周亮，呂可君
（永康市第一人民醫(yī)院，浙江 永康 321300）

目的探討胸水CEA、TTF-1、MC、CR、CK7、EMA抗體在鑒別診斷肺腺癌細胞和反應性增生間皮細胞中的應用。方法選擇轉移性肺腺癌胸水45例及同期非腫瘤性胸水35例，所有納入病例的胸水標準為常規(guī)涂片或液基細胞涂片中發(fā)現有較多數量的腺癌細胞或間皮細胞，離心沉淀物做成細胞塊。檢測細胞塊中CEA、TTF-1、MC、CR、CK7、EMA抗體的表達，探討這些抗體在鑒別診斷胸水中肺腺癌細胞和反應性增生間皮細胞的作用。結果CEA在肺腺癌細胞中的陽性率為93.3%，顯著高于反應性增生間皮細胞（2.9%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；TTF-1在肺腺癌細胞中的陽性率為86.7%，顯著高于反應性增生間皮細胞（0），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；MC在肺腺癌細胞中的陽性率為11.1%，顯著低于反應性增生間皮細胞（91.4%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；CR在肺腺癌細胞中的陽性率為4.4%，顯著低于反應性增生間皮細胞（88.6%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。CK7和EMA在肺腺癌細胞中的表達率與反應性增生間皮細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。結論TTF-1 與CEA在肺腺癌細胞中呈高表達，而CR與MC在反應性增生間皮細胞中高表達，可用于肺腺癌與反應性間皮細胞增生的鑒別診斷。

胸水；細胞塊；肺腺癌細胞；間皮細胞；免疫組織化學

胸水細胞學檢查是肺癌合并胸腔積液患者最常見檢查項目之一，胸水中是否存在腺癌細胞，對肺腺癌患者診斷分期、化學治療及判斷預后至關重要。目前，三級乙等以下基層醫(yī)院病理科胸腹水診斷大多僅僅依靠細胞學涂片，陽性率偏低，主觀性強，特別是分化好的腺癌細胞與增生間皮細胞或者漿膜腔原發(fā)性間皮腫瘤細胞形態(tài)非常相似，鑒別兩者一直是細胞病理診斷的難點［1-2］。近年來，細胞塊技術在細胞學診斷領域取得很大進展［3-4］，本實驗在細胞學制片基礎上，參照文獻方法［5-6］，通過胸水離心后細胞沉淀物包埋做成蠟塊，結合免疫組織化學染色聯合檢測上皮細胞相關抗體和間皮細胞相關抗體，為臨床鑒別肺腺癌細胞和反應性增生間皮細胞提供更可靠的依據，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料2014年1月～2015年8月選擇本院轉移性肺腺癌胸水45例（肺腺癌組），男19例，女26例，年齡40～79歲，中位年齡61.6歲，所有病例均經過手術、纖維支氣管鏡或穿刺病理確診。同時選擇同期非腫瘤性胸水35例 （反應性間皮細胞增生組），男19例，女16例，年齡35～77歲，中位年齡55.8歲。所有納入病例的胸水標準：常規(guī)涂片或液基細胞涂片發(fā)現有較多數量的腺癌細胞或間皮細胞。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑萊卡封閉式脫水機、安必平液基細胞制片儀、安徽中科中佳低速離心機，廣州深達生物制品技術有限公司生產的免疫組化試劑。

1.2.2細胞塊制作方法取新鮮胸水至少100mL，用50mL尖底離心管取兩管胸水置于離心機以2500r/min離心10分鐘，棄去上清液；如細胞沉淀過少，可再將剩余胸水加至離心管離心。棄去上清液，吸取少量沉淀物做常規(guī)涂片或液基細胞制片，剩余沉淀物加入4%中性甲醛10mL，室溫下固定1～24小時；取出沉淀物用包埋濾紙包好，和其他組織學標本放入自動脫水機中進行處理，制成石蠟細胞塊，切片，采用常規(guī)HE染色及免疫細胞化學染色，鏡下分析所見細胞的性質。

1.2.3免疫組化染色所選抗體包括上皮細胞相關抗體：甲狀腺轉錄因子-1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）、癌胚抗原 （CEA）、細胞角蛋白-7 （cytokeratin-7，CK7）、上皮膜抗原（epithelialmembrane antigen，EMA）和間皮細胞相關抗體：間皮細胞蛋白（mesothelial cell，MC）、鈣結合蛋白（calretinin，CR）作為一抗均為單克隆抗體，購自廣州深達生物制品技術有限公司。所有細胞蠟塊連續(xù)切片，厚度約3μm，于60℃烘干l小時，采用EnVision二步法，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，置顯微鏡下觀察。陰性對照采用PBS緩沖液代替一抗，陽性對照采用已證實為陽性的組織切片。陽性信號定位：CEA和CK7定位在細胞漿，TTF-1定位在細胞核，MC和EMA定位在細胞膜，CR定位在細胞漿或者細胞核，以染色呈黃色至棕褐色為陽性反應。腺癌細胞或間皮細胞達到10%以上細胞陽性判斷為陽性。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS11.0統(tǒng)計學軟件對數據進行分析，計數資料采用χ2檢驗。

表1　各抗體在肺腺癌及反應性增生間皮細胞中的陽性表達比較（n，%）

2　結果

CEA在肺腺癌細胞中的陽性率為93.3%，顯著高于反應性增生間皮細胞（2.9%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；TTF-1在肺腺癌細胞中的陽性率為86.7%，顯著高于反應性增生間皮細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；MC在肺腺癌細胞中的陽性率為11.1%，顯著低于反應性增生間皮細胞（91.4%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；CR在肺腺癌細胞中的陽性率為4.4%，顯著低于反應性增生間皮細胞（88.6%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。CK7和EMA在肺腺癌細胞中的表達與反應性增生間皮細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。CEA、TTF-1、MC、CR、CK7、EMA免疫組織化學染色結果見圖1～6。

3　討論

胸腔積液中肺腺癌細胞與反應性增生的間皮細胞形態(tài)有相似之處，有時單通過形態(tài)學特征進行鑒別難以作出正確判斷［1］，同一標本采用單純細胞涂片在不同病理醫(yī)師之間會存在診斷結果的差異。免疫組織化學染色近年來成為胸腔積液細胞學鑒別診斷的有效輔助方法，而細胞塊切片是免疫組織化學染色的良好載體。細胞塊切片背景干凈，較少假陽性情況，容易保存，可作多張切片，便于染色及對比分析［2］。

CEA最初發(fā)現于結腸癌和胎兒腸組織中，故名癌胚抗原，在包括肺癌在內的許多腫瘤中廣泛表達，癌旁正常黏膜CEA含量很少或為陰性。雖然在一些非腫瘤病變（如肺部感染、肝炎、潰瘍性結腸炎等）中CEA水平也會升高，但與惡性腫瘤相比，無論是升高的幅度還是出現的頻率均遠不及后者。腺癌患者CEA水平較其他病理類型腫瘤更高。本文肺腺癌細胞CEA陽性表達率93.3%，顯著高于反應性增生間皮細胞的陽性表達率，可以作為肺腺癌及反應性間皮細胞增生的鑒別診斷。TTF-1屬于NKx2家族成員之一，是一種核蛋白，分子量38kD，主要表達于肺及甲狀腺上皮細胞以及相對應的癌細胞核，其他上皮細胞（如乳腺導管上皮細胞、胃腸道上皮細胞等）和間皮源性細胞均不表達［1］，因此其可用于肺腺癌細胞與間皮細胞的鑒別診斷。本文肺腺癌細胞標本中86.7%TTF-1表達陽性，與既往研究的敏感性54%～89%相似［7］，而間皮細胞內無表達，特異性達到100%。因此TTF-1對轉移性肺腺癌的診斷均有較高的價值，尤其是與反應性增生間皮細胞間的鑒別診斷，特異性達到100%。

MC主要分布在間皮細胞中，定位于細胞膜，而其他腺癌主要定位在細胞漿。MC在漿膜腔內間皮細胞及其腫瘤的陽性表達率達79%［8］，在鑒別肺腺癌細胞和間皮源性細胞具有重要的臨床意義。本文反應性增生間皮細胞中MC的陽性表達率為91.4%，顯著高于肺腺癌細胞中的陽性表達率。說明MC是增生間皮細胞的可靠標記物，可以用于鑒別增生間皮細胞和肺腺癌細胞。CR是神經特異性鈣結合蛋白，屬于肌鈣蛋白C超家族，在增生的間皮細胞以及間皮瘤細胞中定位于細胞漿和細胞核，其在腺癌細胞中表達極低或者不表達。間皮細胞中其陽性表達率達到80%以上［8］。本文胸水細胞塊中反應性增生間皮細胞CR的陽性表達率為88.6%，顯著高于肺腺癌細胞，說明其鑒別診斷反應性增生間皮細胞具有較高的敏感性和特異性。

圖1　CEA在腺癌細胞中的陽性表達（EnVision×400）

圖2　TTF-1在腺癌細胞中的陽性表達（EnVision×400）

圖3　MC在間皮細胞中的陽性表達（EnVision×400）

圖4　CR在間皮細胞中的陽性表達（EnVision×400）

圖5　CK7在腺癌細胞及背景間皮細胞中的陽性表達（EnVision×400）

圖6　EMA在間皮細胞中的陽性表達（EnVision×400）

CK7屬于細胞角蛋白，主要表達在肺、乳腺、胰腺等腺上皮，一般結腸腺上皮不表達。本文CK7在肺腺癌細胞和間皮細胞的陽性表達率分別為95.6%和80.0%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。EMA是一種糖蛋白，主要分布于上皮細胞的腔緣表面膜，是上皮源性腫瘤標志物之一。本文肺腺癌細胞中的EMA陽性表達率和間皮細胞中的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

綜上所述，胸水細胞塊切片用做免疫組織化學染色的載體具有背景清晰、定位良好等優(yōu)點。TTF-1 與CEA在肺腺癌細胞中呈高表達，是肺腺癌的可靠標志物；而CR與MC在反應性增生間皮細胞中高表達，是間皮細胞的可靠標志物，以上指標均可用于肺腺癌與反應性間皮細胞增生的鑒別診斷；而CK7 和EMA在肺腺癌細胞和反應性增生間皮細胞中均有陽性表達，陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義。

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永康市科技計劃項目（201437）