張根花，張楨（浙江省立同德醫(yī)院，浙江杭州310012）

實(shí)驗(yàn)研究

miR-101增強(qiáng)多柔比星對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435的殺傷活性

張根花，張楨
（浙江省立同德醫(yī)院，浙江杭州310012）

目的探討microRNA-101（miR-101）增強(qiáng)多柔比星對乳腺癌細(xì)胞的殺傷活性及機(jī)制。方法用熒光定量PCR方法檢測人正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A及乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435 miR-101的表達(dá)水平。MTT法檢測miR-101對多柔比星體外殺傷MDA-MB-435能力的影響。利用生物信息學(xué)及Western blot方法驗(yàn)證miR-101是否調(diào)節(jié)MDA-MB-435細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)。構(gòu)建Mcl-1真核表達(dá)載體，MTT法檢測Mcl-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對miR-101聯(lián)合多柔比星殺傷MDA-MB-435細(xì)胞療效的影響。結(jié)果（1）多柔比星對轉(zhuǎn)染了miR-101的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435的細(xì)胞活力抑制率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；（2）pcDNA3.1-Mcl-1的共轉(zhuǎn)染顯著抑制了miR-101聯(lián)合多柔比星對MDA-MB-435細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)論miR-101通過下調(diào)Mcl-1的表達(dá)增強(qiáng)多柔比星對乳腺癌細(xì)胞的殺傷活性。

miR-101；Mcl-1；乳腺癌；MDA-MB-435；多柔比星

microRNA是一種內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，長度約為19～25個核苷酸，通過與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)（3′UTR）配對結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能，下調(diào)靶基因的表達(dá)［1］。miR-101（microRNA-101）被報道在多種腫瘤類型如膀胱癌、肝癌細(xì)胞中表達(dá)失衡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)［2-3］，本研究探討miR-101在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，并研究其對多柔比星殺傷乳腺癌細(xì)胞的作用

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435、MCF-7、MDA-MB-231及人正常乳腺細(xì)胞系MCF-10A購于美國ATCC。乳腺癌細(xì)胞系及人正常乳腺細(xì)胞系MCF-10A均培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中（DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco），并加入10μg/mL胰島素，100ng/mL霍亂毒素，20ng/mL人表皮生長因子。所有細(xì)胞在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通入5%CO2。

1.1.2試劑多柔比星、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲亞砜（DMSO）、表皮生長因子（EGF）、霍亂毒素、胰島素購于美國Sigma-Aldrich。兔抗人Mcl-1和兔抗人β-actin購于美國Cell Signaling。PVDF膜購于美國Millipore。ECL試劑盒購于美國Pierce。miR-101模擬物和陰性對照寡核苷酸（NCO）購于上海吉瑪生物，miR-101模擬物序列為：5′-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3′；NCO序列為：5′-GUACUAACCUAUGUGAAAU AG-3′。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pcDNA3.1、Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen。各PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1miR-101的表達(dá)采用熒光定量PCR法檢測，簡要步驟如下：將正常培養(yǎng)條件下的MCF-10A、MDA-MB-435、MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞總RNA用Trizol試劑提取。之后采用莖環(huán)RT-qPCR法（逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR）對miR-101進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增［4］，并以U6作為內(nèi)參，采用2-△△CT法計算miR-101的相對表達(dá)水平［5］。miR-101逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCGGGAC-3′。U6定量PCR上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染將Mcl-1基因cDNA全長序列（Gene ID：NM_001197320）以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成pcDNA3.1-Mcl-1重組真核表達(dá)質(zhì)粒［6］。使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說明書步驟將miR-101或NCO（50pmol/ mL），pcDNA3.1-Mcl（2滋g/mL）轉(zhuǎn)染入MDA-MB-435細(xì)胞中，培養(yǎng)24小時。

1.2.3Western blot試驗(yàn)將50pmol/mL miR-101 用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染入MDA-MB-435細(xì)胞中培養(yǎng)24小時，收集細(xì)胞并裂解，裂解后的蛋白提取液用12.5%的丙烯酰胺進(jìn)行SDS-PAGE，之后將凝膠取下將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。將膜在Mcl-1或β-actin一抗稀釋液中孵育過夜，之后在帶辣根過氧化物酶活性的二抗稀釋液中孵育2小時，ECL試劑顯色曝光。

1.2.4對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性采用MTT法，將MDA-MB-435細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上。將50pmol/mL miR-101或陰性對照RNA（NCO）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，孵育24小時，然后再加低濃度（0.2滋g/mL）或高濃度（1滋g/mL）多柔比星培養(yǎng)48小時。之后加5mg/mL MTT 20滋L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。棄上清液，在570nm波長下用酶標(biāo)儀檢測OD值，細(xì)胞活力抑制率用以下公式計算：抑制率=（OD對照組-OD治療組）/OD對照組×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 12.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理，采用非配對雙邊t檢驗(yàn)以及單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1miR-101在乳腺各細(xì)胞系中的表達(dá)通過熒光定量PCR方法發(fā)現(xiàn)三種乳腺癌細(xì)胞系MDAMB-435、MDA-MB-231和MCF-7的miR-101表達(dá)水平均顯著低于正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A（均P＜0.01），詳見表1。

2.2轉(zhuǎn)染miR-101后多柔比星對MDA-MB-435細(xì)胞的殺傷活性多柔比星對轉(zhuǎn)染了miR-101的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435的細(xì)胞活力抑制率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），提示miR-101可顯著增強(qiáng)多柔比星對乳腺癌的治療效果。

表1　乳腺各細(xì)胞系miR-101的表達(dá)（x±s）

表2　多柔比星聯(lián)合miR-101對MDA-MB-435細(xì)胞的抑制作用（x±s）

2.3miR-101的靶點(diǎn)生物信息學(xué)（http：//www. targetscan.org/）結(jié)果表明Mcl-1是miR-101的潛在靶點(diǎn)（圖1）。MDA-MB-435轉(zhuǎn)染miR-101（50pmol/ mL）后，Mcl-1的表達(dá)量顯著低于未轉(zhuǎn)染miR-101組（圖2）。MTT試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pcDNA3.1-Mcl-1的共轉(zhuǎn)染顯著抑制了 miR-101聯(lián)合多柔比星對MDA-MB-435細(xì)胞的殺傷活性（表3），提示miR-101增強(qiáng)多柔比星對MDA-MB-435細(xì)胞的殺傷活性的機(jī)制可能是通過下調(diào)Mcl-1的表達(dá)水平。

圖1　Mcl-1基因是miR-101的潛在靶點(diǎn)

圖2　轉(zhuǎn)染miR-101下調(diào)MDA-MB-435細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)水平

表3　pcDNA3.1-Mcl-1抑制miR-101對多柔比星的協(xié)同作用（x±s）

3　討論

盡管乳腺癌細(xì)胞很容易發(fā)生耐藥，化療仍是目前治療乳腺癌的主要手段。多柔比星是一種蒽環(huán)類抗生素，是目前最主要的抗腫瘤藥物之一，廣泛用于乳腺癌的治療［7］。雖然多柔比星有十分良好的抗腫瘤活性，但是高劑量的多柔比星也能引起嚴(yán)重的心臟毒性反應(yīng)，而且腫瘤的藥物抵抗也大大限制了多柔比星的臨床應(yīng)用［8］。因此聯(lián)合其他藥物降低多柔比星的毒副反應(yīng)和耐藥性顯得十分重要。

本研究中，作者發(fā)現(xiàn)相比于正常乳腺上皮細(xì)胞系，乳腺癌細(xì)胞系的miR-101表達(dá)水平顯著下調(diào)，表明miR-101在乳腺癌細(xì)胞中可能發(fā)揮腫瘤抑制作用，提示了miR-101可能是一個抑癌基因。然而，研究發(fā)現(xiàn)miR-101單獨(dú)治療乳腺癌的效果并不十分顯著，對細(xì)胞活力抑制率平均（5.6±3.8）%，但是它卻能顯著增強(qiáng)多柔比星對乳腺癌的殺傷作用，聯(lián)合了miR-101的低濃度或者高濃度的多柔比星，其腫瘤細(xì)胞活力抑制率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。

為了研究miR-101增強(qiáng)多柔比星對乳腺癌細(xì)胞殺傷活性的機(jī)制，作者通過生物信息學(xué)方法尋找miR-101的潛在靶點(diǎn)。在miR-101的眾多調(diào)控基因中，作者發(fā)現(xiàn)Mcl-1這一凋亡相關(guān)蛋白可能決定多柔比星對腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性。Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中一個重要的抗凋亡蛋白成員，它的高表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的不良預(yù)后和多藥耐藥密切相關(guān)［9］。有報道表明，腫瘤細(xì)胞中Mcl-1的高表達(dá)會顯著增強(qiáng)多種腫瘤的存活能力和對細(xì)胞毒性化療藥物的抵抗力［10］。因此，作者推測miR-101可能通過下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中Mcl-1的表達(dá)，提高多柔比星對腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性。為了驗(yàn)證這個假設(shè)，本研究構(gòu)建了Mcl-1真核表達(dá)載體，如表2提示，當(dāng)MDA-MB-435細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Mcl-1重組質(zhì)粒，使細(xì)胞中Mcl-1發(fā)生過表達(dá)后，miR-101對多柔比星的協(xié)同抗乳腺癌作用受到顯著抑制，證實(shí)了miR-101增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤活性的機(jī)制是靶向于Mcl-1蛋白。

綜上所述，miR-101/Mcl-1途徑與多柔比星的抗乳腺癌活性密切相關(guān)，它可能成為腫瘤化療的一個新的靶點(diǎn)。

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