趙艷玲，李興旺，朱永林（.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州3507；.溫州市人民醫(yī)院，浙江 溫州35000）

纈沙坦對雄性成年大鼠生殖功能安全性的初步探討

趙艷玲1，李興旺1，朱永林2
（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州325027；2.溫州市人民醫(yī)院，浙江 溫州325000）

目的研究纈沙坦對雄性成年大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的影響。方法40只90天齡SD雄性大鼠，隨機(jī)分為對照組和纈沙坦組，每組20只，對照組給予玉米油（2mL/kg），纈沙坦組給予纈沙坦（15mg/kg）持續(xù)灌胃，灌胃7天后腹腔注射75 mg/kg二甲基磺酸乙烷（ethane dimethane sulfonate，EDS）。EDS后第4天、14天、21天、35天各處死大鼠5只，采集血液、留取睪丸，采用放射免疫法（RIA）測定血清睪酮（T）、促黃體生成素（LH）水平；睪丸間質(zhì)細(xì)胞特異性的羥類固醇 （3β-HSD）可由3β-HSD染色來鑒定，組織染色后使用圖像分析軟件估計睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)。結(jié)果EDS后第4天、14天、21天、35天，兩組血清T和LH水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。結(jié)論纈沙坦對雄性大鼠成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育無明顯影響，對雄性成年大鼠生殖功能較安全，進(jìn)一步研究需對睪丸間質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志基因進(jìn)行測定。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞；纈沙坦；睪酮；生殖功能

流行病學(xué)調(diào)查表明，慢性腎臟?。–KD）及高血壓的發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢，中青年男性人群高血壓患病率逐年上升，降壓/降低尿蛋白的控制血壓、延緩腎功能進(jìn)展的常規(guī)用藥是ACEI（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑）和ARB（血管緊張素受體拮抗劑）。大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞具有較高的血管緊張素Ⅱ （AⅡ）親和性受體，此受體激活可抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜腺苷酸環(huán)化酶活性，減少間質(zhì)細(xì)胞釋放睪酮［1］。纈沙坦是ARB的一種，目前其對成年雄性生殖內(nèi)分泌細(xì)胞即睪丸間質(zhì)細(xì)胞（adult Leydig cell，ALC）發(fā)育和功能的影響國內(nèi)外尚無研究［2］，因其關(guān)乎優(yōu)生優(yōu)育，具有重要意義。本文就纈沙坦對雄性成年大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的影響報道如下。

1　材料與方法

1.1材料40只90天齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～250g，平均（219.2±37.0）g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗室 （清潔級）（編號 SCXK （滬）2013-0005），全部大鼠在正常溫控光照和自由攝食條件下飼養(yǎng)。XH-6020γ計數(shù)儀、顯微鏡和數(shù)碼相機(jī)由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院科研中心提供；纈沙坦（代文）由諾華公司提供；硝酸藍(lán)四唑（NBT）購自Am resco公司；二甲基磺酸乙烷、醇酮購自稞新材料科技（上海）有限公司；睪酮（T）、促黃體生成素（LH）測定試劑盒（testosterone reagent kit）購自天津九鼎公司。

1.2方法40只90天齡SD雄性大鼠，隨機(jī)分為對照組和纈沙坦組，每組20只，對照組給予溶媒玉米油（2mL/kg），纈沙坦組按照15mg/kg予以纈沙坦持續(xù)灌胃，每天1次，灌胃7天后，腹腔單次注射給予每只大鼠 75mg/kg二甲基磺酸乙烷（ethane dimethane sulfonate，EDS）處理，EDS是一種烷化劑，高度選擇性殺死睪丸間質(zhì)細(xì)胞，大鼠接受單次腹腔注射75mg/kg EDS后，4天時清除睪丸間質(zhì)細(xì)胞，睪丸間質(zhì)內(nèi)不能見到睪丸間質(zhì)細(xì)胞。EDS處理后第4天、14天、21天、35天各處死大鼠5只，采集血液、留取睪丸。血液以3000r/min離心20分鐘，收集血清，保存于-20℃，用于血清T、LH水平測定；冰凍睪丸，進(jìn)一步組織化學(xué)染色。

1.3檢測指標(biāo)

1.3.1激素水平測定采用放射免疫測定法測定血清T、LH水平。按照試劑盒操作步驟，使用標(biāo)準(zhǔn)血清和樣品，分別加入125I-T和125I-LH作為閃標(biāo)，進(jìn)行測定，T和LH的批內(nèi)變異系數(shù)＜8%，批間變異系數(shù)＜10%。

1.3.2組織化學(xué)染色睪丸間質(zhì)細(xì)胞通過組織化學(xué)染色進(jìn)行鑒定。方法：取睪丸冰凍切片，厚8μm。睪丸間質(zhì)細(xì)胞具有特異性標(biāo)志物，即羥類固醇脫氫酶 （3β-HSD）。在該酶的作用下，0.4mmol醇酮、1mg NBT和輔酶（NAD+）發(fā)生反應(yīng)，NBT被還原，生成藍(lán)色雙蟻脂沉淀沉積于睪丸間質(zhì)細(xì)胞的胞漿部位。用二脒基苯基吲哚（DAPI）染細(xì)胞核。睪丸切片通過上述組織化學(xué)染色后，連接到計算機(jī)的顯微鏡和數(shù)碼相機(jī)來觀察染色情況，并使用圖像分析軟件估計細(xì)胞數(shù)（計數(shù)每100個小管中含有藍(lán)色雙蟻脂沉淀細(xì)胞數(shù)）。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)值采用（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2　結(jié)果

2.1血清T、LH水平EDS后第4天、14天、21天、35天，兩組血清T和LH水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1　兩組血清T、LH水平的比較（x±s，ng/mL）

2.2睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)采用3β-HSD染色測定EDS處理后第4天、14天、21天、35天兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞見圖1～4。在EDS處理后第4天、14天、21天、35天，兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

圖1　EDS處理后第4天兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞（1A：對照組；1B：纈沙坦組）

圖2　EDS處理后第14天兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞（2A：對照組；2B：纈沙坦組）

圖3　EDS處理后第21天兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞（3A：對照組；3B：纈沙坦組）

圖4　EDS處理后第35天兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞（4A：對照組；4B：纈沙坦組）

表2　兩組睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)的比較（x±s）

3　討論

雄性哺乳動物體內(nèi)睪酮主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌，因而睪酮含量的下降很大程度上與間質(zhì)細(xì)胞功能相關(guān)，血清中低睪酮水平通過負(fù)反饋機(jī)制引起LH分泌增多。EDS處理模型可以很好地觀察成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育過程［3-4］。單次腹腔注射EDS后，成年睪丸內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞被完全清除。睪丸間質(zhì)細(xì)胞的喪失導(dǎo)致循環(huán)內(nèi)LH升高，LH同其他局部生長因子和細(xì)胞因子促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的增生和分化。血清睪酮是反映睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生的指標(biāo)［5］。本實驗中血清T在EDS處理后第4天沒有測出，但之后恢復(fù)，說明睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育。

大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞具有較高的血管緊張素Ⅱ（AⅡ）親和性受體，此受體激活可抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜腺苷酸環(huán)化酶活性，減少間質(zhì)細(xì)胞釋放睪酮［1］。纈沙坦為血管緊張素受體拮抗劑，可能影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜腺苷酸環(huán)化酶活性及間質(zhì)細(xì)胞釋放睪酮，可能增加局部血管緊張素濃度，進(jìn)而影響精子發(fā)生過程和下丘腦-腦垂體-睪丸軸分泌功能。目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究。

本實驗分別測定EDS處理后第4天、14天、21天、35天兩組T及LH水平，EDS處理后第4天兩組LH均較高，而T不能測出；第35天時兩組T較高，而LH較低，兩組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），故纈沙坦對成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育過程影響不大。研究中采用3β-HSD染色測定EDS處理后第4天、14天、21天、35天睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)第4天兩組少見睪丸間質(zhì)細(xì)胞，此后逐漸增多，第35天時較多，同時間段兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），纈沙坦未導(dǎo)致EDS處理后成年大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)發(fā)生明顯改變，說明纈沙坦對雄性成年大鼠生殖功能安全性較好。

通過實驗證實，應(yīng)用纈沙坦治療，短期內(nèi)未見睪丸間質(zhì)細(xì)胞增生發(fā)生異常，但長期使用或加倍劑量使用的安全性有待進(jìn)一步觀察，包括睪丸間質(zhì)細(xì)胞分化情況、測定睪丸間質(zhì)細(xì)胞分化基因等。

［1］ 劉繼紅，凌青.高血壓與勃起功能障礙相互關(guān)系研究進(jìn)展.中華男科學(xué)雜志，2011，17（8）：675

［2］ Leung PS，Sernia C.The renin-angiotensin system and male reproduction；newfunctionsforoldhormones.JMol Endocrinol，2003，30（3）：263

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［4］ Ariyaratne S，Kim I，Mills N，et al.Mendis-Handagama C. Effects of ethane dimethane sulfonate on the functional structure of the adult rat testis.Arch Androl，2003，49 （4）：313

［5］Akingbemi BT，Ge R，Klinefelter GR，et al.Phthalateinduced Leydig cell hyperplasia is associated with multiple endocrine disturbances.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101 （3）：775

溫州市科學(xué)技術(shù)局科技計劃項目（Y20120042）