董方圓 王昕 丁小滿 彭博 武偉華 劉慧 耿藝介 鄭青 房師松

510632廣州，暨南大學藥學院（董方圓、鄭青）；510632廣州，中山大學公共衛(wèi)生學院（丁小滿）；518055深圳市疾病預防控制中心（王昕、彭博、武偉華、劉慧、耿藝介、房師松）

α-2，6唾液酸受體結合特異性的H7N9流感病毒的篩選

董方圓 王昕 丁小滿 彭博 武偉華 劉慧 耿藝介 鄭青 房師松

510632廣州，暨南大學藥學院（董方圓、鄭青）；510632廣州，中山大學公共衛(wèi)生學院（丁小滿）；518055深圳市疾病預防控制中心（王昕、彭博、武偉華、劉慧、耿藝介、房師松）

目的 篩選與α-2，6唾液酸受體結合特異性的H7N9流感病毒。方法 運用隨機突變技術處理A/Shenzhen/1/2013（H7N9）流感病毒HA蛋白頭部受體結合域；用反向遺傳學技術將其NA基因和突變的HA基因與A/PR/8/34（H1N1）流感病毒的6個內部基因進行基因重組，構建H7N9流感病毒突變病毒庫。并用α2-3唾液酸酶處理的紅細胞篩選與α-2-6唾液酸受體結合特性的H7N9流感病毒。結果 篩選出3種類型與α-2，6唾液酸受體結合特異性的H7N9流感病毒突變株。突變位點分別為I126V、S194P/A435S、D127V/S136G/A169T。結論 從構建的H7N9流感病毒突變病毒庫中成功篩選出與α-2，6唾液酸受體結合特異性的H7N9流感病毒。

【主題詞】 H7N9流感病毒；隨機突變技術；反向遺傳學

Fund programs：Shenzhen Science and Techno1ogy P1anning Projects（JCYJ20140410164811662）

自2013年3月，我國首次發(fā)現人感染H7N9流感病毒病例以來，該病毒對人的感染逐漸擴散至我國多省，給我國公共衛(wèi)生帶來嚴峻的挑戰(zhàn)，通常該病毒以低致病性狀態(tài)穩(wěn)定存在于家禽中，但人感染后會引起重癥肺炎及多器官衰竭，死亡，嚴重地威脅著人們的健康。目前H7N9禽流感病毒在哺乳動物間不能持續(xù)傳播，但是一旦它在自然界中獲得在人間有效傳播的變異或重配，將會給人類帶來不可估量的損失［1］。

流感病毒的跨物種傳播能力主要取決于HA蛋白受體結合區(qū)域，主要包括130環(huán)、190螺旋和220環(huán)［2］。通常人流感病毒的HA特異地與Saα2-6Ga1受體結合，而禽流感病毒的HA特異地與Saα2-3Ga1受體結合。已有研究發(fā)現HA受體結合區(qū)氨基酸位點的突變，使H5N1禽流感病毒，不但能特異性的選擇Saα-2，6Ga1，還可以在雪貂之間傳播［3］。本實驗采用隨機突變和反向遺傳技術，通過對HA蛋白受體結合區(qū)域隨機突變，構建以PR8內部基因為骨架的H7N9流感病毒隨機突變病毒庫，并初步篩選出與α-2-6受體結合特性的H7N9流感病毒，為進一步探討H7N9流感病毒在哺乳動物中有效傳播的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1病毒株、雞胚和細胞株 A/Human/Shenzhen/ 1/2013（H7N9）流感病毒源于深圳市疾病預防控制中心病毒庫，保存于-80℃。雞胚SPF級、MDCK細胞、293T細胞由深圳市疾病預防控制中心提供。

1.2質粒和載體 反向遺傳系統pCDNA-RG［4］由本實驗室自行構建；pGEM-T easy vector購自于Promega公司。

1.3引物設計與合成 根據A/Human/Shenzhen/ 1/2013（H7N9）HA基因序列設計一對HA基因RTPCR擴增引物，序列如下：Bm-H7N9-HA：5′-TAC GTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGGAT-3′；Bm-HAH7N9-1732R：5′-TACGTCTCGTATTAGTAGAAACAA GGGTGTTTT-3′。引物引入BsmBI酶切位點酶切后與BsmBI酶切的pCDNA-RG載體核酸片斷粘性互補。

根據已知NA基因序列設計一對NA基因RTPCR擴增引物序列如下：Ba-NA-H7N9：5′-TAGGT CTCCGGGAGCGAAAGCAGGGTCAA-3′Ba-NA-H7N 9-1413R：5′-TAGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGG GTCTTTTT-3′。引物引入BsaI酶切位點酶切后與BsmBI酶切的pCDNA-RG載體核酸片斷粘性互補。因對HA蛋白120-259受體結合區(qū)域進行隨機突變，根據已知HA序列采用重疊PCR技術設計引物：HA 377-411 F：5′-TTGACAAGGAAGCAATGG GATTCACATACAG TGGA-3′；HA 832-854 R：5′-TTG GCATCAACCTG TACTCCACT-3′；HA 838-871 F：5′-GTACAGGTTGATGCCAATTGTGAAGGGGACTGCT-3′；HA 382-405 R：5′-GTATGTGAATCCCATTGCTT CCTT-3′。引物均由日本TaKaRa公司合成。

1.4病毒 RNA提取和 RT-PCR的擴增 A/ Human/Shenzhen/1/2013（H7N9）流感病毒RNA用High pure vira1 RNA kit（Roche）試劑盒提取；采用One Step RT-PCR Kit（TaKaRa）對 HA和NA片段擴增。

1.5HA蛋白120-259受體結合區(qū)域隨機突變 以HA序列為模板，用 TaKaRa PrimeSTAR HS DNA Po1ymerase擴增HA蛋白120-259受體結合區(qū)域、受體結合區(qū)域上游序列和下游序列。以HA 377-411 F 和HA 832-854 R為上下游引物，擴增HA蛋白120-259受體結合區(qū)域；以Bm-H7N9-HA和HA 382-405 R為上下游引物擴增受體結合區(qū)域上游序列；以HA 838-871 F和Bm-HA-H7N9-1732R為上下游引物擴增受體結合區(qū)域下游序列。以HA蛋白120-259受體結合區(qū)域為模板（650 ng）用隨機突變試劑盒GeneMorph II Random Mutagenesis Kit（Agi1ent公司）對該片段進行隨機突變，經PCR純化試劑盒純化后，取1 μ1與pGEM-T easy vector連接，轉化，涂板，挑選20株送TaKaRa測序，計算突變庫容量。根據重疊 PCR技術，以 Bm-H7N9-HA，Bm-HA-H7N9-1732R為引物用DNA Po1ymerase將所有HA受體結合區(qū)域隨機突變序列與其上游和下游序列拼接成完整的HA序列［4］。

1.6HA序列、NA序列與pCDNA-RG載體連接

正常的HA（標記為HA-1）序列和拼接的突變HA（標記為HA-2）序列分別用BsmBI酶切與BsmBI酶切的pCDNA-RG載體核酸片斷連接，轉化感受態(tài)細胞JM109。提取質粒pCDNA-RG-HA-1（H7N9）和pCDNA-RG-HA-2（H7N9）。NA序列用BsaI酶切后與BsmBI酶切的pCDNA-RG載體核酸片斷連接并轉化感受態(tài)細胞JM109。提取質粒pCDNA-RG-NA （H7N9），提取質粒均送TaKaRa測序。

1.7細胞轉染與病毒拯救 重組H7N9病毒的拯救，將 8質粒 pCDNA-RG-PA、pCDNA-RG-PB1、pCDNA-RG-PB2、pCDNA-RG-NS、pCDNA-RG-NP、pCDNA-RG-M與 pCDNA-RG-HA（H7N9）、pCDNARG-NA（H7N9）各1 μg，加入無血清、無抗生素的Opti-MEM細胞培養(yǎng)液使總體積為250 μ1，取32 μ1脂質體 1ipofectamine 2 000加入到218 μ1的Opti-MEM細胞培養(yǎng)液中，混合均勻室溫靜置5 min，與已加入質粒的250 μ1 Opti-MEM細胞培養(yǎng)液混合作用20 min，再加入Opti-MEM細胞培養(yǎng)液2.5 m1使總體積為3 m1，轉染進入含有293T和MDCK兩種細胞 （細胞生長至形成致密的單層，兩種細胞各占50%）的6孔板中。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，換成含有10%FBS的 DMEM完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，換成接種液（含有5 μg/m1 TPCK-trypsin的 DMEM細胞培養(yǎng)液）在35℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后收集細胞上清液，做血凝試驗檢測血凝效價［5］。轉染細胞時做陽性對照（拯救毒株A/PR/8/34（H1N1）的8個質粒）和陰性對照（不含pCDNA-RG-HA、pCDNA-RGNA的六個質粒）。

1.8接種雞胚擴大培養(yǎng)病毒 拯救出的重組病毒命名為rH7N9，將rH7N9病毒轉染上清液接種到兩枚9日齡的 SPF雞胚尿囊腔，每只雞胚接種 200 μ1，37℃孵化72 h后收集尿囊液，測定血凝效價，保存于-80℃。

1.9紅細胞處理與病毒篩選 取豚鼠血，加入阿氏液中，PBS洗滌3次，用PBS配成20%的紅細胞懸液，取 1 m1加入 1000 U的 α2，3 Neuraminidase （NEB）于37℃敷育20 h，PBS洗滌3次，用含有1% BSA的PBS配成10%的α2-3唾液酸酶處理的紅細胞懸液。突變的病毒與100 μ1此紅細胞懸液在4℃敷育10 min，含有1%BSA的PBS洗滌10次。病毒在MDCK擴大培養(yǎng)后，噬斑純化挑取單病毒測序。

1.10噬斑試驗與噬斑純化試驗 取篩選后培養(yǎng)的病毒液用DMEM做1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000的比例稀釋，將病毒取1 m1/每孔加入長至90%的MDCK細胞6孔板中。37℃孵育2 h后，棄掉接種液，PBS洗滌2次，加入含有1%低熔點瓊脂糖的無酚紅DMEM接種液（胰酶終濃度為5 μg/ m1），30 min凝固后，將6孔板倒置于35℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后觀察空斑，染色處理（10%甲醛固定2 h、1%結晶紫處理1 min、水流沖洗），根據噬斑實驗結果選擇合適的稀釋比例進行噬斑純化實驗，噬斑純化與噬斑實驗相同只是不再進行染色。直接挑選空斑接種到90%的MDCK的96孔板培養(yǎng)72 h，逐步擴大到24孔板、6孔板中培養(yǎng)，做血凝試驗檢測血凝效價［6］。收毒提取病毒RNA，RT-PCR擴增HA片段，送TaKaRa公司測序。

1.11病毒受體結合特異性檢測 通過固相受體檢測方法對分離得到的突變株進行受體結合特異性檢測。病毒純化，PBS將4種病毒稀釋到血凝效價64后，加入96孔高效結合微孔板50 μ1/孔，PBS做陰性對照，4℃過夜，100 μ1 1%BSA的PBS封閉2 h，PBS洗3遍，分別加入不同濃度的3′SLN-PAA和6′SLN-PAA，100 μ1/孔，37℃避光孵育2 h。PBST洗3遍，加入Streptavidin-HRP、100 μ1/孔，37℃避光孵育2 h，PBST洗3遍。加入 TMB顯色液、100 μ1/孔，37℃避光孵育25 min后加入終止液，檢測450 nm波長吸光度。

1.12病毒繁殖動力學實驗 將H7N9以及3種突變的病毒，將病毒按照MOI=0.001稀釋后，分別接種的MDCK細胞中進行培養(yǎng)，放在35℃5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每天取上清于-80℃凍存。培養(yǎng)7天后，進行血凝實驗，記錄血凝實驗結果。

1.13生物安全 本實驗在深圳市疾病預防中心，微生物檢驗樓生物安全三級實驗室進行。

A：1-2空白對照和HA（120-259）受體結合區(qū)域上游序列；3-4空白對照和HA（120-259）受體結合區(qū)域序列；5-6空白對照和HA（120-259）受體結合區(qū)域序列下游序列；B：1空白；2隨機突變的HA（120-259）序列；C：1 HA基因融合片段（1 732 bp）；2空白；M DL2000 bp DNA Marker圖1　重疊PCR和易錯PCR凝膠電泳結果A：1-2 Contro1 and the upstream sequence of HA（120-259）receptor binding region；3-4 Contro1 and the sequence of HA receptor binding region；5-6 Contro1 and the upstream sequence of HA receptor binding region；B：1-2 Contro1 and random mutation sequence of HA（120-259）；C：1-2 Fusion PCR products of recombinant HA sequence（1 732 bp）and contro1；M DL2000 bp DNA MarkerFig.1 The resu1t of error-prone PCR and over1ap-PCR agarose ge1 e1ectrophoresis

2 結果

2.1HA蛋白120-259受體結合區(qū)域隨機突變 庫容量計算1 μ1（共100 μ1）目的片段連接后體系為10 μ1，取2 μ1轉化，白斑陽性克隆4088個，陰性對照無陽性克隆。隨機挑選20株測序，共有13株序列突變位點完全不同、7株沒有突變。突變率為65%。突變庫容量：陽性克隆×突變率×轉化次數×總體積=4088×65% ×5×100=1.33×106（cfu/ 100 μ1）=1.33×107cfu/m1。

2.2重組質粒的構建 H7N9的HA基因與NA基因與pCDNA-RG連接，轉化大腸埃希菌JM109，挑取單菌落進行PCR擴增HA和NA序列。陽性質粒送TaKaRa公司測序，測序結果表明HA和NA序列均成功克隆到pCDNA-RG載體上。

2.3重組病毒拯救結果和雞胚擴大培養(yǎng)血凝效價

轉染293T和MDCK細胞換成接種液培養(yǎng)72 h后，細胞出現明顯病變，細胞培養(yǎng)上清中rH7N9流感病毒血凝效價為1∶16；陽性對照H1N1流感病毒的血凝效價為1∶64；陰性對照孔無細胞病變，細胞培養(yǎng)上清血凝效價為0。接種雞胚72 h后收集尿囊液，進行血凝實驗，對照H1N1流感病毒血凝效價為1∶128、rH7N9流感病毒血凝效價為1∶64（如圖2）。

A：細胞上清的血凝效價：C：空白；1：H1N1流感病毒；2-4：重組H7N9流感病毒；B：雞胚尿囊液的血凝效價：1：H1N1流感病毒；2-4：重組H7N9流感病毒圖2　拯救病毒的血凝效價結果A：HA titer of ce11 supernatant；C：Contro1；1：HA titer of H1N1 inf1uenza virus；2-4：HA titer of rH7N9 inf1uenza virusB：HA titer of the chicken embryo a11antoic f1uid.；1 H1N1 inf1uenza virus；2-4：rH7N9 inf1uenza virusFig.2 Hemagg1utination titer of rescued inf1uenza virus

2.4噬斑試驗 經α2-3唾液酸酶處理的豚鼠血細胞篩選的 H7N9流感病毒經擴大培養(yǎng)后從10-1-10-5依次稀釋做噬斑試驗（圖3），以此作先導實驗以確認合適噬斑純化濃度。根據先導實驗選擇將病毒稀釋10-3來進行噬斑純化。

行：1-3：均為rH7N9禽流感病毒列：從左至右H7N9流感病毒稀釋倍數依次為10-1，10-2，10-3，10-4，10-5圖3　rH7N9流感病毒空斑實驗結果Line：1-3：A11 are rH7N9 inf1enza virus；Co1umn：From 1eft to right seria1 10-fo1d di1utions of rH7N9 inf1enza virus：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5Fig.3 P1aque assay of rH7N9 inf1enza virus

表1　測序結果突變分析Tab.1 Mutation ana1ysis of the sequencing resu1ts

圖4　各流感病毒分離株的受體結合特性Fig.4 Characterization of the receptor-binding properties of iso1ated viruses

圖5　H7N9流感病毒分離株的體外增殖曲線Fig.5 In vitro pro1iferation curve of iso1ated H7N9 inf1uenza viruses

2.5噬斑純化試驗及序列測定 經噬斑純化試驗，共分離到15株rH7N9流感病毒。分別提取15株rH7N9病毒總RNA，RT-PCR擴增HA基因并進行序列測定。rH7N9與A/Shenzhen/1/2013（H7N9）流感病毒的HA基因序列比對，發(fā)現有14株rH7N9發(fā)生突變。具體突變位點如表1。其中第1、2、3、4、5、6株rH7N9 HA基因突變類型一致，為S194P和 A435S；第7株沒有突變；第8株rH7N9 HA基因突變位點為，I126V；第 9、10、11、12、13、14、15株rH7N9 HA基因突變類型一致，為D127V、S136G和A169T；總共得到3種類型的突變株，NCBI上分析發(fā)現在現有毒株中均沒有發(fā)現這些突變株的存在。

2.6糖苷固相受體結合試驗 對篩選得到的3種類型的H7N9流感病毒突變株以及H7N9未突變株分別做固相受體結合試驗，實驗結果如圖4：與H7N9未突變株相比，I126V突變株對α-2，6唾液酸受體和α-2，3唾液酸受體的結合能力影響不大。S194P/A435突變株與D127V/S136G/A169T突變株均增強了對α-2，6唾液酸受體結合能力，而且D127V/S136G/A169T突變株的對α-2，6唾液酸受體結合能力要大于對α-2，3唾液酸受體結合能力。

2.7病毒繁殖動力學試驗 對3株突變株H7N9 與rH7N9陽性株分別做繁殖動力學實驗，發(fā)現在前4 d，3株突變株的體外復制能力均 ＞rH7N9。D127V/S136G/A169T毒株的體外復制能力要高于其他毒株。5天后，病毒滴度均趨于平穩(wěn)狀態(tài)。研究結果說明受體結合區(qū)域的突變會影響病毒的體外增殖，我們篩選的3株H7N9初期均在一定程度上提高病毒的體外復制能力，后期僅D127V/S136G/ A169T突變株提高了病毒的體外復制能力。

3 討論

已有研究發(fā)現新的H7N9禽流感病毒HA基因具有226L哺乳動物易感標記，且PB1基因的627位點為賴氨酸，通常E627K為PB2蛋白的重要毒力改變位點，PB1-F2羧基端的L62、R75、R79、L82四個位點，使得禽流感病毒具有高致病力的特征［7-8］。且體外受體結合實驗表明，該病毒對Saα2-6Ga1和Saα2-3Ga1受體均能結合，與Saα2-3Ga1受體結合能力大于Saα2-6Ga1受體［9］。目前還未發(fā)現人傳人的案例，該病毒對人類來說還是新型的病毒，人體還沒有對其產生有效的免疫體制［10］。2011年Yoshihiro Kawaoka等通過對H5N1禽流感病毒的HA（氨基酸位點120-259）受體結合區(qū)域隨機突變，逐步發(fā)現HA基因序列上某些氨基酸位點的改變，不但能夠增強H5N1禽流感病毒與Saα2-6Ga1受體的結合能力，還能夠使流感病毒在雪貂模型中有效傳播［3］?；诖?，通過對H7N9流感病毒的HA頭部受體結合區(qū)域進行隨機突變，構建H7N9流感病毒突變病毒庫。

豚鼠血細胞表面具有Saα2-6Ga1受體和Saα2-3Ga1受體，Saα2-6Ga1受體要遠多于Saα2-3Ga1受體［11］。本研究用過量的α2-3唾液酸酶處理掉豚鼠血細胞表面Saα2-3Ga1受體，使豚鼠血細胞僅具有Saα2-6Ga1受體，進而用該處理的紅細胞進行篩選與Saα2-6Ga1受體特異性結合的H7N9流感病毒。本研究共篩選4株，一株是沒有突變的毒株，這點與病毒本身能與α2-6Ga1受體結合相一致。測序結果顯示突變位點多數在HA受體結合部位，也有部分突變在其他位點，這可能是病毒為能更好的適應相應的突變體系而做出的自身突變。本研究初步篩選3株對α-2，6受體結合特異性的H7N9流感病毒，且S194P/A435S突變株與D127V/S136G/A169T突變株均在體外水平上增強了對α2-6Ga1受體結合能力。D127V/S136G/A169T突變株的體外增殖能力也有一定提高，下一步我們可以通過雪貂模型實驗研究突變株的體內感染動力學和有效傳播，從HA 3D結構生物學，膜融合PH依賴實驗和溫度耐受實驗，進一步研究突變體對α2-6Ga1受體結合特異性的分子機制。

本研究提供了初步篩選α-2，6受體結合特異性的H7N9流感病毒的平臺，有助于了解某些位點的改變會增加病毒與人受體結合的能力，提高我們對H7N9禽流感病毒變化的檢測能力，有助于我們應對可能出現的H7N9在人類傳染中的變化。

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Screening of H7N9 influenza virus with alpha 2，6 receptors bindin
g preference

Dong Fangyuan，Wang Xin，Ding Xiaoman，Peng Bo，Wu Weihua，Liu Hui，Geng Yijie，Zheng Qing，Fang Shisong Department of medicine，Jinan University，Guangzhou 510322，China（Dong FY，Zheng Q）；Shenzhen Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen 518055，China（Ding XM）；School of Public Health，Sun Yat?sen University，Guangzhou 510322，China（Wang X，Peng B，Wu WH，Liu H，Geng YJ，Fang SS）

Fang Shisong，Email：szcdcssf@aliyun.com；Zheng Qing，Email：tzhengq@jnu. edu.cn

ObjectiveScreening of H7N9 inf1uenza virus with a1pha 2，6 receptors binding preference.Methods We introduced random mutations into the g1obu1ar head of A/Shenzhen/1/2013 （H7N9）HA.And then，to generate a reassortant H7N9 virus 1ibrary，p1asmids for the synthesis of the mutated HA gene and the unmodified NA gene of H7N9 were transfected into 293T and MDCK ce11s together with p1asmids for the synthesis of the six remaining vira1 genes of A/Puerto Rico/8/34（H1N1）.We screened reassortant H7N9 inf1uenza virus by RBCs treated with α2-3Neuraminidase.Results We screened three strains of reassortant H7N9 inf1uenza virus with a1pha 2，6 receptors binding preference in this study. Mutation sites of three variants are I126V，S194P/A435S and D127V/S136G/A169T.Conclusion We successfu11y screen the reassortant H7N9 inf1uenza virus with a1pha 2，6 receptors binding preference from H7N9 virus 1ibrary.

H7N9 inf1uenza virus；Random mutagenesis；Reverse genetics

深圳市科技計劃項目（JCYJ20140410164811662）

房師松，Emai1：szcdcssf@a1iyun.com；鄭青，Emai1：tzhengq@jnu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.004

2016-01-20）