孫麗娜 周榮蘋(píng) 劉洋 蕪為 李川 仇佩虹 李德新 梁米芳

102206北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所（孫麗娜、劉洋、蕪為、李川、李德新、梁米芳）；325035溫州醫(yī)科大學(xué)（周榮蘋(píng)、仇佩虹）

4株埃博拉病毒核蛋白特異性單克隆抗體抗原結(jié)合表位研究

孫麗娜 周榮蘋(píng) 劉洋 蕪為 李川 仇佩虹 李德新 梁米芳

102206北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所（孫麗娜、劉洋、蕪為、李川、李德新、梁米芳）；325035溫州醫(yī)科大學(xué)（周榮蘋(píng)、仇佩虹）

目的 分析鼠埃博拉病毒核蛋白（NP）特異性單克隆抗體抗原結(jié)合表位，了解其免疫學(xué)特性。方法 經(jīng)生物信息學(xué)分析后，將NP分段重組表達(dá)，并分別以之為抗原，通過(guò)免疫印跡和競(jìng)爭(zhēng)ELISA的方法對(duì)4株埃博拉病毒核蛋白特異性單抗的抗原結(jié)合表位進(jìn)行分析。結(jié)果 經(jīng)生物信息學(xué)表位分析后將埃博拉病毒全長(zhǎng)核蛋白分為rNP1-418，rNP419-639和rNP640-739三段進(jìn)行重組制備，免疫印跡法分析表明4株鼠單抗均識(shí)別線性表位，結(jié)合位點(diǎn)位于C端100 aa。通過(guò)對(duì)C端100 aa 即rNP640-739 N端連續(xù)截短20 aa的方法進(jìn)行鑒定，4株鼠單抗抗原表位位于埃博拉核蛋白C末端20 aa，但其中2株單抗無(wú)明顯競(jìng)爭(zhēng)。結(jié)論 明確了具有不同結(jié)合位點(diǎn)的埃博拉核蛋白特異性單抗，為免疫學(xué)快速檢測(cè)試劑的研究奠定基礎(chǔ)。

【主題詞】 埃博拉病毒；核蛋白；抗原表位

Fund programs：State Mega-project for Infectious Disease Research of China（2013ZX10004-101）

埃博拉病毒（Ebo1a virus，EBOV）可導(dǎo)致嚴(yán)重的出血熱，病死率高，主要通過(guò)直接接觸患者的血液和排泄物傳播。迄今，尚無(wú)有效的治療藥物及疫苗。［1］EBOV為單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組編碼7種不同的蛋白質(zhì)，其中核蛋白NP全長(zhǎng)739個(gè)氨基酸，是病毒核衣殼中含量最豐富的病毒蛋白，能夠與病毒RNA基因組相互作用，其C端區(qū)域?qū)τ诓《镜霓D(zhuǎn)錄及核衣殼的自我裝配非常關(guān)鍵，在病毒復(fù)制中發(fā)揮重要作用［2，3］。EBOV感染早期診斷主要依賴(lài)于抗原及核酸檢測(cè)，基于單抗的免疫學(xué)抗原檢測(cè)方法可發(fā)展為適合現(xiàn)場(chǎng)使用的快速檢測(cè)試劑［4］。本研究將EBOV核蛋白進(jìn)行分段表達(dá)，通過(guò)免疫印跡和競(jìng)爭(zhēng)ELISA的方法對(duì)4株鼠單抗的抗原結(jié)合表位進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒、單抗 表達(dá)埃博拉病毒核蛋白（EBOVNP）的重組質(zhì)粒pET28a-EBOV-NP及其表達(dá)純化核蛋白抗原由本室構(gòu)建并保存；抗Ebo1a-NP的鼠單抗1D10、1G9、1B7、1H8以及人鼠嵌合單抗1D10及1B7均由本室制備并保存。

1.2競(jìng)爭(zhēng)ELISA 采用重組埃博拉病毒核蛋白作為包被抗原，用2株定量的人鼠嵌合單抗1D10、1B7分別與不同稀釋度的鼠單抗1D10、1G9、1B7、1H8混合競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合核蛋白抗原，抗人Fc酶標(biāo)二抗檢測(cè)人鼠嵌合單抗。

1.3埃博拉核蛋白分段表達(dá) 首先采用Protean分析埃 博 拉 核 蛋 白 （GenBankAccessionNo. KU182909.1）親水性及抗原表位區(qū)域，以重組質(zhì)粒PET28a-EBOV-NP為模板將EBOV-NP進(jìn)行分段表達(dá)。設(shè)計(jì)EBOV-NP分段擴(kuò)增引物（表1）分別擴(kuò)增NP不同片段，回收純化 PCR產(chǎn)物，經(jīng)SacI/XhoI雙酶切后，直接克隆到帶有HIS標(biāo)簽原核表達(dá)載體pET28a中。對(duì)重組克隆進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定，挑選陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)化BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDSPAGE鑒定其表達(dá)。

表1　分段表達(dá)埃博拉rNP的引物Tab.1 Sequence of primers used for generation of the truncated EBOV rNPs

1.4免疫印跡法分析抗原表位區(qū)域 利用Western B1ot（WB）對(duì)4株鼠單抗（1D10，1G9，1B7，1H8）所針對(duì)的NP抗原表位進(jìn)行分析?？乖謩e為原核表達(dá)重組核蛋白及其分段表達(dá)產(chǎn)物，陽(yáng)性對(duì)照抗體為抗HIS標(biāo)簽抗體，待測(cè)抗體為鼠單抗1D10，1G9，1B7，1H8。將抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜。分別與待測(cè)抗體室溫反應(yīng)2 h，加入HRP標(biāo)記抗鼠IgG全抗（1∶2000，美國(guó)Sigma），室溫輕柔振蕩1 h后DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1競(jìng)爭(zhēng)ELISA 為了探索前期篩選制備的4株鼠單抗1D10，1G9，1B7，1H8的核蛋白抗原結(jié)合表。首先采用埃博拉核蛋白為檢測(cè)抗原進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析，將4株鼠單抗所針對(duì)的抗原表位進(jìn)行初步歸類(lèi)。結(jié)果顯示人鼠嵌合抗體1B7同自身鼠單抗1B7競(jìng)爭(zhēng)，與其他3株鼠單抗及陰性對(duì)照（SFTSV糖蛋白鼠單抗）均不競(jìng)爭(zhēng)（圖1A）；人鼠嵌合抗體與1D10 與H8存在明顯競(jìng)爭(zhēng)、與1G9存在一定程度的競(jìng)爭(zhēng)，與鼠單抗1B7及陰性對(duì)照（SFTSV糖蛋白鼠單抗）不存在競(jìng)爭(zhēng)（圖1B）。

圖1　競(jìng)爭(zhēng)ELISAFig.1 Competition ELISA

2.2埃博拉核蛋白分段表達(dá)及其抗原表位鑒定

圖2　埃博拉病毒核蛋白抗原表位區(qū)間預(yù)測(cè)Fig.2 The prediction of epitopes on nuc1eoprotein of Ebo1a virus

埃博拉核蛋白氨基酸序列經(jīng)protean分析如圖2顯示，NP抗原表位從大約419 aa起至C端存在大量明顯抗原高峰，N端1-418 aa區(qū)間存在 少量抗原峰，與文獻(xiàn)報(bào)道其抗原峰主要位于C端相符。為了初步限定4株鼠單抗與NP抗原結(jié)合的范圍，本研究在已有重組核蛋白rNP全長(zhǎng)739 aa的基礎(chǔ)上根據(jù)抗原表位預(yù)測(cè)分析結(jié)果，將NP分節(jié)段原核表達(dá)。首先，在抗原峰分界41aa處分段，獲得rNP1-418，其余C端整個(gè)抗原高峰區(qū)419-739 aa進(jìn)一步分段研究，即 C端截?cái)?00 aa，分為2段 rNP419-639和rNP640-739。Western B1ot分析對(duì) 4株鼠單抗（1D10，1G9，1B7，1H8）與分段表達(dá)重組核蛋白的特異性反應(yīng)，同時(shí)利用陽(yáng)性對(duì)照抗HIS標(biāo)簽抗體鑒定核蛋白各分段表達(dá)產(chǎn)物。如圖2結(jié)果顯示，全長(zhǎng)rNP1-739及 3個(gè)片段 rNP1-418，rNP419-639和rNP640-739與抗HIS抗體WB反應(yīng)均為陽(yáng)性，說(shuō)明重組核蛋白抗原均得到正確表達(dá)；4株鼠單抗與rNP1-739及rNP640-739均存在特異性反應(yīng)，而與rNP1-418及rNP419-639均不反應(yīng)，由此我們將4株鼠單抗所針對(duì)的抗原表位初步限定在埃博拉核蛋白640-73aa區(qū)間，即C端100個(gè)氨基酸內(nèi)。

利用pET2 8a載體表達(dá)體系將C端100個(gè)氨基酸C末端不變，N端每段截短20 aa，即為rNP660-739（80 aa）、rNP680-739（60 aa）、rNP700-739（40 aa）、rNP719-739（20 aa）。Western B1ot分析顯示，rNP660-739、rNP680-739、rNP700-739及rNP719-739與抗HIS抗體反應(yīng)均為陽(yáng)性，說(shuō)明這些重組抗原均得到正確表達(dá)；4株鼠單抗與rNP660-739、rNP680-739、rNP700-739、rNP719-739均存在特異性反應(yīng)，由此我們將4株鼠單抗所針對(duì)的抗原表位限定在埃博拉核蛋白C端20 aa附近（圖3）。

圖3　鼠單抗針對(duì)埃博拉病毒核蛋白分段表達(dá)產(chǎn)物的抗原表位結(jié)合活性分析Fig.3 Epitope mapping of MAbs to a pane1 of the truncated rNP of EBOV in WB ana1ysis

3 討論

本研究利用DNAStar protean分析核蛋白氨基酸序列顯示抗原表位主要位于419 aa起至C末端，而N端1-418aa區(qū)間存在較多疏水性氨基酸，抗原表位少，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［4，5］。有研究揭示扎伊爾埃博拉病毒核蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域rNP641-739在病毒復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］，并在感染者的血液中存在較高濃度的NP抗原，是EBOV感染免疫學(xué)檢測(cè)試劑的重要靶標(biāo)。雙抗體夾心檢測(cè)抗原是經(jīng)典的免疫檢測(cè)方法，為提高檢測(cè)試劑的敏感性，需兩種抗體無(wú)明顯的競(jìng)爭(zhēng)活性。為研發(fā)適合現(xiàn)場(chǎng)使用的EBOV快速檢測(cè)試劑，本研究通過(guò)重組表達(dá)核蛋白rNP全長(zhǎng)739 aa以及系列截短的核蛋白rNP1-418 共8種抗原，利用WB分析表明4株鼠單抗均識(shí)別線性表位，抗原結(jié)合表位位于C端20 aa附近，說(shuō)明C端區(qū)域確實(shí)是埃博拉病毒核蛋白抗原表位主要區(qū)域，具有很強(qiáng)的抗原性，可以作為診斷研究的重要靶點(diǎn)。競(jìng)爭(zhēng)ELISA將4株鼠單抗所針對(duì)的抗原表位大致歸為3類(lèi)，分別為1D10與H8相互競(jìng)爭(zhēng)，1D10 與1G9存在一定程度的競(jìng)爭(zhēng)，1B7與其他3株鼠單抗均不競(jìng)爭(zhēng)。這說(shuō)明在埃博拉核蛋白C端20 aa附近至少分布有3種不同抗原表位，利用重疊多肽掃描等方法在C端20 aa附近的范圍對(duì)三種抗原表位進(jìn)行精確定位。

［1］ Awah PK，Boock AU，Kum KA.Ebo1a Virus Diseases in Africa：a commentary on its history，1oca1 and g1oba1 context.Pan Afr Med J，2015，11：22-24.doi：10.11694/pamj.supp.2015.22. 1.6652.

［2］ Dziubańska PJ，Derewenda U，E11ena JF，a1 et.The structure of the C-termina1 domain of the Zaire ebo1avirus nuc1eoprotein.Acta Crysta11ogr D Bio1 Crysta11ogr，2014，70（Pt 9）：2420-2429. doi：10.1107/S1399004714014710.

［3］ Dong S，Yang P，Li G，et a1.Insight into the Ebo1a virus nuc1eocapsid assemb1y mechanism：crysta1 structure of Ebo1a virus nuc1eoprotein core domain at 1.8 ? reso1ution.Protein Ce11，2015，6：351-362.doi：10.1007/s13238-015-0163-3.

［4］ Saijo M，Niikura M，Ikegami T，et a1.Laboratory diagnostic systems for Ebo1a and Marburg hemorrhagic fevers deve1oped with recombinant proteins.C1in Vaccine Immuno1，2006，13：444-451.doi：10.1128/CVI.13.4.444-451.2006

［5］ Peters CJ，LeDuc JW.An Introduction to Ebo1a：The Virus and the Disease.Infec Dis，1999，179（supp1 1）：ix-xvi.

Study on the epitopes of four monoclonal antibodies specific to ebola virus nucleoprotein

Sun Lina，Zhou Rongping，Liu Yang，Wu Wei，Li Chuan，Qiu Peihong，Li Dexin，Liang Mifang National Institute for Viral Disease Control and Prevention，China CDC，Beijing 102206，China（Sun LN，Liu Y，Wu W，Li C，Li DX，Liang MF）；Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China（Zhou RP，Qiu PH）

Liang Mifang，Email：mifangl@vip.sina.com

Objective To ana1ysis the epitope of Ebo1a virus（EBOV）nuc1eoprotein（NP）and understand its immuno1ogica1 properties.Methods First1y four mouse mAbs recognizing the different epitopes of Ebo1a virus NP were c1assified by competition ELISA.The fu11-1ength NP and the C-termina1 were truncated and expressed in E.co1i.according to epitope prediction by software and some pub1ished papers. Epitope mapping of mAbs to a pane1 of the truncated rNP were identified in WB ana1ysis.Results After epitope prediction，the fu11-1ength NP were divided into rNP1-418，rNP419-639 and rNP640-739.WB ana1ysis indicated that mAbs a11 recognized the 1inear epitopes，which were 1imited in the C-termina1 100aa （rNP640-739）.The truncated N proteins with N-termina1 of rNP640-739 series 20aa de1etions reacted with a C11o nmcAl ubssi.onThe epitopes recognized by anti-NP mAbs were defined near the C-termina1 20aa of EBOV NP. Ana1ysis of antigenic epitopes of EBOV NP by specific mAbs as a probe 1ay the foundation for the study of immuno1ogy diagnostic reagents.

Ebo1a virus；Nuc1eoprotein（NP）；Epitope

“傳染病防治”科技重大專(zhuān)項(xiàng)：重大傳染病應(yīng)急處置檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)（2013ZX10004-101）

梁米芳，Emai：mifang1@vip.sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.007

2016-01-18）