李維善　李德超　邱蓉蓉

佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜病科，佳木斯 154007

牙齦卟啉單胞菌對兔血管內(nèi)皮組織中白細(xì)胞介素-33表達(dá)的影響

李維善李德超邱蓉蓉

佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜病科，佳木斯 154007

目的用牙齦卟啉單胞菌感染兔建立動脈粥樣硬化（AS）模型，觀察感染兔主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中白細(xì)胞介素-33（IL-33）的變化，探討牙齦卟啉單胞菌與AS的關(guān)系。方法將24只新西蘭大白兔分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組每周1次靜脈注射牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)液，持續(xù)12周，建立感染兔AS模型；對照組每周1次注射等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)13周處死實(shí)驗(yàn)動物，觀察主動脈血管的組織結(jié)構(gòu)；通過免疫組織化學(xué)染色、實(shí)時熒光半定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和Western blot法檢測兔主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中IL-33 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-33 mRNA相對表達(dá)量為58.244±2.407，IL-33蛋白相對表達(dá)量為1.863±0.171，對照組IL-33 mRNA相對表達(dá)量為3.143±0.805，IL-33蛋白相對表達(dá)量為0.537±0.028；實(shí)驗(yàn)組IL-33的mRNA和蛋白的表達(dá)量均明顯高于對照組（P＜0.01）。結(jié)論牙齦卟啉單胞菌感染能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IL-33，可能對AS的發(fā)生發(fā)展有一定的調(diào)節(jié)作用。

牙齦卟啉單胞菌；血管內(nèi)皮組織；白細(xì)胞介素-33；動脈粥樣硬化

牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎的主要致病菌。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病中最常見的一種炎癥性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。已有研究［1］表明，微生物感染在AS發(fā)病中起重要作用。炎癥學(xué)說已成為AS的研究熱點(diǎn)。已有研究［2］發(fā)現(xiàn)，牙周炎和AS間存在相關(guān)性，炎癥因子可能是兩者相關(guān)性的橋梁和紐帶。白細(xì)胞介素-33（interleukin-33，IL-33）在炎癥、感染、自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的作用，與AS的發(fā)生發(fā)展也關(guān)系密切［3］。IL-33 是AS的保護(hù)因子，其含量變化可提示AS的嚴(yán)重程度。目前牙齦卟啉單胞菌對IL-33表達(dá)影響的研究還比較少見。本研究通過牙齦卟啉單胞菌感染AS動物模型來觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞中IL-33的表達(dá)，以探討牙齦卟啉單胞菌在AS中的作用。

1　材料和方法

1.1細(xì)菌的培養(yǎng)與鑒定

牙齦卟啉單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33277（廣東省微生物菌種保藏中心提供）復(fù)蘇后接種于哥倫比亞血平板上，厭氧罐內(nèi)37 ℃培養(yǎng)3～5 d，革蘭染色后鏡檢，油鏡下可見革蘭染色陰性的紅色桿狀菌體。于腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)增菌，用麥?zhǔn)媳葷岱▽㈣b定后的菌液配制成密度為1×107CFU·mL-1。

1.2實(shí)驗(yàn)分組

選擇24只新西蘭大白兔（佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供）作為實(shí)驗(yàn)動物，體重為2.0～2.5 kg，隨機(jī)分為兩組。實(shí)驗(yàn)組18只，靜脈注射100 μL密度為1× 107CFU·mL-1牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)液，每周1次，持續(xù)12周，建立牙齦卟啉單胞菌感染的AS模型［4］；對照組6只，每周1次靜脈注射100 μL生理鹽水。13周后處死所有動物，取兔主動脈，部分用10%甲醛溶液固定，用于組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，余下部分使用液氮保存，用于基因和蛋白質(zhì)表達(dá)情況的檢測。

1.3主動脈的病理組織學(xué)觀察

主動脈標(biāo)本切片采用蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）常規(guī)染色，制成病理組織切片，顯微鏡下觀察。

1.4IL-33表達(dá)的檢測

1.4.1主動脈血管內(nèi)皮中IL-33的分布采用免疫組織化學(xué)染色法觀察主動脈血管內(nèi)皮中IL-33的分布。血管組織經(jīng)修整后，脫水、透明、浸蠟和包埋，采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行染色。標(biāo)本切片，室溫下孵育5～10 min，滴加一抗和二抗（Santa Cruz公司，美國），顯色，復(fù)染，中性樹膠封片，置于Motic3000顯微攝影系統(tǒng)下于400倍下攝片，觀察IL-33染色情況，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，且著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者判定為陽性。采用Image-pro plus 6.0病理圖像分析系統(tǒng)對IL-33陽性表達(dá)進(jìn)行半定量分析，以積分光密度（integral optical density，IOD）代表IL-33蛋白的相對表達(dá)量。IOD測量方法為陽性面積×平均光密度。每組隨機(jī)分析6個高倍視野，取其均值代表該組IL-33的相對表達(dá)量。

1.4.2主動脈血管內(nèi)皮中IL-33 mRNA的表達(dá)每組各選取5個樣本，采用實(shí)時熒光半定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測IL-33 mRNA的表達(dá)［5］，每個樣品重復(fù)3次，采用FR-2000型圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描，光密度測量結(jié)果代表mRNA的相對表達(dá)量，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)所用引物序列如下:上游引物，5'-CCAGAATAGTGAGAGTGGGGAA-3'；下游引物，5'-CGCATGTAGTAAGGTGGGAACC-3'；產(chǎn)物長度為110 bp。

1.4.3IL-33蛋白的表達(dá)量采用Western blot法檢測IL-33蛋白的表達(dá)量［6］。對照組和實(shí)驗(yàn)組各取3只兔的主動脈，用蛋白裂解液提取蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH ）為內(nèi)參。每個樣品取20 μg蛋白質(zhì)上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。冰上90 V電壓下轉(zhuǎn)膜90 min，BSA封閉，置搖床上1 h，孵育一抗，4 ℃過夜，次日TBST洗3次，室溫下孵育二抗1 h，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，用凝膠圖形分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，比較實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1兔主動脈組織學(xué)觀察

對照組主動脈血管平整、致密，內(nèi)膜完整，彈力纖維和平滑肌纖維規(guī)整；實(shí)驗(yàn)組可見內(nèi)膜層有不程度增厚，并向管腔內(nèi)輕度凸出，形成斑塊，內(nèi)膜主要為泡沫細(xì)胞（圖1）；該結(jié)果證實(shí)AS動物模型建模成功。

2.2免疫組織化學(xué)染色

IL-33的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖2:IL-33的陽性表達(dá)主要集中于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色。實(shí)驗(yàn)組IOD值為2 253.848±195.689，對照組為1 803.587± 184.653，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組相對表達(dá)量高于對照組。

圖1　血管內(nèi)皮細(xì)胞的組織學(xué)觀察　HE　× 200Fig　1　Histological observation of vascular endothelial cells　HE　× 200

圖2　IL-33的表達(dá)　免疫組織化學(xué)染色　× 200Fig　2　The expressions of IL-33　immunohistochemistry　× 200

2.3IL-33 mRNA的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組IL-33的mRNA相對表達(dá)量為58.244± 2.407，對照組為3.143±0.805，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4IL-33蛋白的表達(dá)

IL-33蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果見圖3，實(shí)驗(yàn)組相對表達(dá)量為1.863±0.171，對照組為0.537± 0.028，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對照組（P＜0.01）。

圖3　IL-33的Western blot檢測Fig　3　Western blot analysis of IL-33

3　討論

牙齦卟啉單胞菌是目前公認(rèn)的慢性牙周炎的主要致病菌，其慢性感染可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，脂蛋白代謝，凝血以及血小板功能等［7］，損傷牙周組織和局部血管生理功能。研究［8］發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌感染可誘導(dǎo)豬冠狀動脈和主動脈AS的形成，為其建立動物模型提供了佐證。

目前認(rèn)為，AS是炎癥性疾?。?］，是血管內(nèi)膜損傷導(dǎo)致脂質(zhì)沉積和纖維組織增生的過程，是一種大中動脈的慢性炎癥反應(yīng)［10］，其發(fā)生發(fā)展始終伴隨著炎癥反應(yīng)，長期感染亦是炎癥性心血管疾病的危險因素［11］。牙周炎是微生物感染引起的慢性感染性疾病，可引起齦溝液等局部組織的炎癥細(xì)胞因子水平升高，而高水平的炎癥細(xì)胞因子與AS形成密切相關(guān)。Li等［12］發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)靜脈注射牙齦卟啉單胞菌后AS病變范圍擴(kuò)大。Lalla等［13］發(fā)現(xiàn)，小鼠局部感染牙齦卟啉單胞菌后，AS斑塊數(shù)目增加，AS的病變范圍也增加了40%，且在主動脈檢測出牙齦卟啉單胞菌DNA的存在。Jain等［14］建立AS模型，用絲線結(jié)扎磨牙并接種牙齦卟啉單胞菌誘發(fā)牙周炎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生牙周炎的兔動脈壁上脂質(zhì)沉積增加，說明牙齦卟啉單胞菌是AS的潛在危險因素。

IL-33是白細(xì)胞介素-1家族的一員，在許多免疫疾病中有多向效應(yīng)，對炎癥有雙向調(diào)控作用［15］。在自身免疫性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病中有促炎作用，而對多種心血管疾病有保護(hù)作用。IL-33主要表達(dá)在成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中。IL-33在內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核中積聚，具有促使血管內(nèi)皮的免疫反應(yīng)輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）1向Th2轉(zhuǎn)化的作用，由此發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮的功能。AS的炎癥反應(yīng)主要由Th1細(xì)胞分化及其激活的炎癥細(xì)胞因子驅(qū)動，Th1細(xì)胞有促進(jìn)AS斑塊失穩(wěn)定作用［16］，而Th2介導(dǎo)的反應(yīng)可抑制AS斑塊的形成和促進(jìn)已形成斑塊的溶解，IL-33可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，減少Th1相關(guān)因子分泌，增加Th2因子的分泌［17］，因此IL-33可能在AS發(fā)展中起保護(hù)作用。IL-33的表達(dá)水平可提示AS的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牙齦卟啉單胞菌感染后致使AS模型的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)IL-33的分布、基因和蛋白表達(dá)均增加，提示牙齦卟啉單胞菌在AS發(fā)展過程中有促進(jìn)作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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（本文編輯吳愛華）

Effects of Porphyromonas gingivalis on interleukin-33 expression in rabbit vascular endothelium tissues

Li Weishan，Li Dechao， Qiu Rongrong.（Dept. of Periodontal and Mucosal Diseases， The Affiliated Stomatology Hospital of Jiamusi University， Jiamusi 154007， China）
Supported by: The Research Project of The Education Department of Heilongjiang Province （12531707）； The Fund of Graduate Student Research Innovation in Jiamusi University （LM2014-041）. Correspondence: Li Weishan， E-mail: weishanli666@ 126.com.

ObjectiveTo investigate interleukin-33 （IL-33） in the arterial vascular endothelium of rabbits infected with Porphyromonas gingivalis （P. gingivalis）， and to explore the relationship between P. gingivalis and atherosclerosis. Methods A total of 24 rabbits were randomly divided into control and experimental groups. The experimental group received intravenous injection of P. gingivalis once a week for 12 weeks to establish a coronary atherosclerosis model. The rabbits in the control group were injected with equal volume of physiological saline. All the rabbits were killed after 13 weeks. The IL-33 expression levels in the arterial vascular endothelium of the rabbits were detected through immunohistochemistry， reverse transcription polymerase chain reaction， and Western blot analysis. The effects of P. gingivalis on the IL-33 expression in the arterial vascular endothelium of the rabbits were analyzed. ResultsThe relative expression levels of IL-33 mRNA in the vascular endothelium cells were 58.244±2.407， and the relative expression levels of IL-33 protein were 1.863±0.171 in the experimental group. The relative expression levels of IL-33 mRNA were 3.143±0.805， and the relative expression levels of IL-33 protein were 0.537± 0.028 in the control group. The expression levels of IL-33 mRNA and protein of vascular endothelium cells in the experimental group were significantly higher than those of the control group （P＜0.01）. ConclusionP. gingivalis infection promotes IL-33 expression levels in vascular endothelial cells and may regulate the occurrence and development of atherosclerosis.

Porphyromonas gingivalis；vascular endothelium tissue；interleukin-33；atherosclerosis

R 780.2

A

10.7518/hxkq.2016.04.007

2015-11-23；

2016-03-12

黑龍江省教育廳科研基金（12531707）；佳木斯大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金（LM2014-041）

李維善，副主任醫(yī)師，碩士，E-mail:weishanli666@126. com

李維善，副主任醫(yī)師，碩士，E-mail:weishanli666@126. com