孫文華　陳國慶　田衛(wèi)東

1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610065；2.口腔疾病研究國家重點實驗室　華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)）；3.口腔再生醫(yī)學(xué)國家地方聯(lián)合工程實驗室（四川大學(xué)），成都 610041

S100A9在糖尿病大鼠牙周組織中的表達及其作用研究

孫文華1，2，3陳國慶2，3田衛(wèi)東2，3

1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610065；2.口腔疾病研究國家重點實驗室華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)）；3.口腔再生醫(yī)學(xué)國家地方聯(lián)合工程實驗室（四川大學(xué)），成都 610041

目的研究S100A9蛋白在糖尿病大鼠牙周組織中的表達，探討其在糖尿病誘發(fā)的牙周病變中可能的作用機制。方法本實驗通過對SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）構(gòu)建糖尿病大鼠模型，通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察糖尿病大鼠牙周結(jié)構(gòu)的變化，免疫組織化學(xué)染色觀察糖尿病大鼠牙周組織中S100A9的表達與分布，同時檢測其配體Toll受體4（TLR4）和核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）/p-P65蛋白的表達。通過分析上述蛋白的表達規(guī)律，探討S100A9蛋白在糖尿病誘發(fā)的牙周病變中的作用機制。結(jié)果糖尿病大鼠的牙槽骨骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏，硬骨板消失；免疫組織化學(xué)染色顯示牙周膜、牙槽骨及牙齦上皮中S100A9的表達水平比對照組明顯上調(diào)，TLR4在牙槽骨、牙周膜、牙齦中的表達水平相較于對照組也顯著增強；p-P65在對照組中沒表達，但在糖尿病組中牙周膜和牙槽骨中呈陽性表達。結(jié)論糖尿病導(dǎo)致大鼠牙周組織結(jié)構(gòu)病變，其原因可能與S100A9介導(dǎo)的TLR4和NF-κB信號通路的活化有關(guān)。

S100A9；牙周病變；糖尿?。籘oll受體4；核轉(zhuǎn)錄因子κB

糖尿病是一類以高血糖為特征的代謝性疾病，主要的病理生理基礎(chǔ)為兩種，胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗。牙周炎同樣屬于多發(fā)高發(fā)的慢性疾病，是一類由細菌引起的慢性牙周感染，導(dǎo)致牙周組織破壞、牙槽骨吸收、牙周袋內(nèi)形成潰瘍等癥狀的疾病。糖尿病患者出現(xiàn)牙周炎的概率比正常人要高出3～5倍。研究［1］發(fā)現(xiàn)糖尿病會導(dǎo)致因牙周微生物群引起的過度炎性反應(yīng)，使牙周組織修復(fù)功能受損，進而導(dǎo)致牙周組織的進一步破壞。牙周炎也會影響糖尿病患者的血糖調(diào)控機制［2］，促發(fā)糖尿病的多種并發(fā)癥發(fā)生，但兩者間的相互關(guān)系尚未完全明確。

S100A9是S100蛋白家族的一員，在體內(nèi)可和S100A8形成異源二聚體，S100A9自身也能形成同源二聚體，臨床中大多數(shù)炎癥患者血清中S100A9及其同源二聚體和形成的異源二聚體的表達量都呈明顯的升高［3］。S100A9和S100A8結(jié)合形成的異源二聚體是S100A9在體內(nèi)最穩(wěn)定的生理結(jié)構(gòu)［4］，有推測S100A9的生理活性形態(tài)是在和S100A8結(jié)合后，也有研究［5］發(fā)現(xiàn)S100A8/A9二聚體可調(diào)控細胞的凋亡，且具有一定的抗菌能力［6］。然而，目前就S100A9在糖尿病導(dǎo)致的牙周病變中的表達和作用機制的研究甚少。

S100A9蛋白功能多樣，可高親和性地結(jié)合Ca2+、Zn2+等離子，參與細胞遷移、骨髓細胞成熟［7］、酪蛋白激酶抑制、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程［8］。該蛋白主要表達于中性粒細胞和單核細胞的胞質(zhì)中，少量表達于細胞核、細胞骨架和質(zhì)膜上。體內(nèi)S100A9大概分為分泌型和胞內(nèi)型兩種，胞內(nèi)主要以鈣離子依賴的方式調(diào)節(jié)細胞活性，分泌型S100A9蛋白則位于胞外通過結(jié)合晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycation end products receptor，RAGE）和Toll受體（Tolllike receptor，TLR）發(fā)揮生物學(xué)功能。研究［9］發(fā)現(xiàn)S100A9蛋白通過RAGE作用于P38、P42/44和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路，以激活核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）進而導(dǎo)致一系列的生物學(xué)反應(yīng)。本課題旨在研究分泌型S100A9蛋白在糖尿病大鼠牙周組織中的高表達和牙周組織病變的關(guān)聯(lián)，以及S100A9蛋白對TLR、NF-κB信號通路的作用。

1　材料和方法

1.1主要試劑

S100A9（稀釋比例為1∶200，Thermo公司，美國），TLR4（稀釋比例為1∶200，Abcam公司，美國），p-P65（稀釋比例為1∶200，Santa Cruz公司，美國），鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma公司，美國）。

1.2方法

1.2.1糖尿病大鼠模型建立選取8周齡雄性SD大鼠30只，體重250～300 g，隨機選取20只作為糖尿病模型組（實驗組），10只為對照組。現(xiàn)配0.1 mol·L-1pH為4.5的檸檬酸緩沖液溶解STZ，22 μm孔徑濾器過濾除菌，注射用量以60 mg·kg-1體重為準，腹腔注射一次；正常對照組以0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液作為對照。在腹腔給藥前12 h嚴格禁食，給藥后可自由取食。模型組分別在給藥48 h、1周后取尾靜脈血測定血糖，血糖值≥16.5 mmol·L-1視為造模成功。此后每周檢測血糖，飼養(yǎng)過程中一旦發(fā)現(xiàn)血糖恢復(fù)正常者或死亡者均視為造模失敗。按照標(biāo)準實驗動物規(guī)定飼養(yǎng)。

1.2.2組織固定和切片制作對照組和實驗組大鼠在以STZ注射12周后取材，實驗組和對照組分別注射10%水合氯醛2 mL麻醉致死后取下頜組織，立即置于4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h，PBS緩沖液清洗2～3次，置于10%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）中進行脫鈣處理12周。組織脫鈣完成后，進行梯度乙醇脫水，70%、80%、90%乙醇各1 h，100%乙醇2 h2次，組織置于二甲苯中1 h 2次，進行浸蠟包埋，制作8 μm切片。

1.2.3蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化處理后，依次PBS緩沖液清洗5 min×2次，蘇木素染色5 min，雙蒸水清洗5 min× 2次，伊紅染色10 min，雙蒸水清洗5 min×2次，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹脂封片。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色免疫組織化學(xué)染色采用ABC法進行，詳細步驟如下:石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化處理后，以3%H2O2室溫處理20 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶；切片經(jīng)PBS漂洗后進行抗原修復(fù)、羊血清封閉；隨后切片滴加相應(yīng)一抗后37 ℃孵育2 h，4 ℃過夜；二抗37 ℃孵育1 h，室溫下DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色效果，PBS漂洗終止顯色，蘇木素復(fù)染30 s，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色半定量分析染色結(jié)果的半定量分析以多數(shù)細胞的陽性染色程度進行評分:從陰性到強陽性分為4個等級:0分為陰性（-），1分為弱陽性（+），2分為陽性（++），3分為強陽性（+++）。切片置于高倍鏡下觀察，每張切片至少選取4個視野進行綜合評分。

1.3數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計

采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，對實驗組和對照組的血糖和體重等計量資料進行正態(tài)性檢驗，用均數(shù)±標(biāo)準差進行統(tǒng)計描述，采用t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.01為差異顯著。

2　結(jié)果

2.1糖尿病大鼠模型構(gòu)建

實驗組和對照組大鼠血糖分別為（29.22±4.47）、（5.41±0.96） mmol·L-1，實驗組大鼠血糖水平顯著高于對照組（P＜0.001）。實驗組和對照組大鼠體重分別為（241.08±46.23）、（332.54±34.39） g， 實驗組大鼠體重顯著下降（P＜0.001）。由此表明糖尿病大鼠模型建立成功。

2.2大鼠下頜牙周組織結(jié)構(gòu)的改變

通過組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組大鼠牙槽骨中骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏并且散亂，骨吸收明顯增加，在牙周膜與牙槽骨相銜接的一層硬骨板被完全破壞（圖1），表明糖尿病導(dǎo)致大鼠牙周炎性病變或外傷。

圖1　糖尿病大鼠和正常大鼠牙周組織形態(tài)學(xué)觀察　HEFig　1　The histomorphology observation of diabetic and control rats' periodontium　HE

2.3S100A9在糖尿病大鼠下頜牙周組織中的表達

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，S100A9在糖尿病大鼠牙槽骨、牙周膜和牙齦組織中均有表達，且主要集中于細胞質(zhì)中表達。與對照組相比，S100A9在牙周膜中的表達增強；在牙齦組織中的表達明顯增強，且主要集中于牙齦上皮中；在牙槽骨中出現(xiàn)顯著上調(diào)（圖2）。通過半定量分析對染色組織進行評分，S100A9蛋白在正常大鼠牙周膜、牙齦、牙槽骨中的表達評分分別為1、2、1；在糖尿病大鼠牙周膜、牙齦、牙槽骨中的表達評分分別為2、3、2。

圖2　S100A9蛋白在糖尿病和正常大鼠牙周中的表達　免疫組織化學(xué)染色　× 400Fig　2　The expression of S100A9 in the periodontium of diabetic and control rats　immunohistochemical staining　× 400

2.4TLR4和p-P65在糖尿病大鼠牙周組織中的表達

TLR4在牙周膜、牙齦上皮和牙槽骨中均有陽性表達。與對照組相比，TLR4在糖尿病大鼠牙周膜中的表達更強；在牙齦中TLR4的表達僅局限于牙齦上皮中，相比于對照組表達明顯上調(diào)；在對照組牙槽骨中TLR4的表達較低，而在糖尿病大鼠牙槽骨中TLR4的表達明顯增強且更為廣泛（圖3）。通過半定量分析對染色組織進行評分，TLR4蛋白在正常大鼠牙周膜、牙齦、牙槽骨中的表達評分均為1。在糖尿病大鼠牙周膜、牙齦、牙槽骨中的表達評分分別為2、3、3。

p-P65在對照組的牙周組織中均無表達，在糖尿病大鼠牙周膜和牙槽骨中均出現(xiàn)較為明顯的表達，而在糖尿病大鼠牙齦組織中不表達（圖4）。通過半定量分析對染色組織進行評分，p-P65蛋白在正常大鼠牙周膜、牙齦、牙槽骨中的表達評分均為0，在糖尿病大鼠牙周膜、牙齦、牙槽骨中的表達評分分別為1、0、2。

圖3　TLR4蛋白在糖尿病和正常大鼠牙周中的表達　免疫組織化學(xué)染色　× 400Fig　3　The expression of TLR4 in the periodontium of diabetic and control rats　immunohistochemical staining　× 400

圖4　p-P65蛋白在糖尿病和正常大鼠牙周中的表達　免疫組織化學(xué)染色　× 400Fig　4　The expression of p-P65 in the periodontium of diabetic and control rats　immunohistochemical staining　× 400

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠的牙周組織中，牙槽骨吸收明顯增加，骨小梁稀疏，且與牙周膜結(jié)合的硬骨板破壞；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示S100A9表達顯著上調(diào)，TLR4和NF-κB信號活化水平顯著增加。研究［10］發(fā)現(xiàn)S100A9/A8復(fù)合物激活NF-κB信號通路，而本實驗組檢測到的TLR4和NF-κB/p-P65在糖尿病大鼠牙周組織中激活，推測S100A9蛋白高表達可能通過激活NF-κB和TLR4信號通路促進牙周炎癥的發(fā)生，增加牙槽骨的骨吸收。

以往研究表明，糖尿病會引起成骨細胞的分化功能障礙［11］，導(dǎo)致下頜骨骨密度降低［12］，糖尿病引起的S100A9表達水平增加與炎癥密切相關(guān)［13］，并且可能通過TLR4［14］和NF-κB［5］信號通路發(fā)揮作用。已有研究［15］發(fā)現(xiàn)在S100A9敲除的小鼠體內(nèi)，通過抗原誘導(dǎo)形成的骨關(guān)節(jié)炎模型中骨吸收明顯被抑制，據(jù)此推測糖尿病導(dǎo)致的牙周結(jié)構(gòu)的改變可能是與S100A9介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和S100A9對骨吸收的促進有關(guān)。在目前的臨床案例中，糖尿病和牙周炎關(guān)系密切，而且糖尿病患者會有更高的概率患牙周炎。有研究［16］表明高血糖會誘導(dǎo)骨髓髓系祖細胞的增殖和擴增，釋放單核細胞進入血液循環(huán)，并且會促進中心粒細胞分泌S100A8/A9蛋白。本研究糖尿病大鼠模型中，單是從牙周組織來看，牙周被嚴重破壞，推測糖尿病大鼠牙槽骨骨髓腔單核細胞會被激活分泌S100A9蛋白，并釋放到牙周組織中，促使牙周組織中細胞炎性發(fā)生，促進破骨細胞分化，加強牙槽骨中破骨性骨吸收，而糖尿病大鼠的牙齦上皮中S100A9高表達是組織被細菌侵入，S100A9表達的增強有著微生物抵抗的作用［6］，實驗中S100A9在牙齦上皮中的表達很高，可能預(yù)示著糖尿病大鼠的牙齦已被微生物感染；S100A9的內(nèi)源性配體TLR4，作為牙周炎中牙齦上皮表達的信號蛋白［17］，檢測到的TLR4在牙齦中的高表達也有文獻證實，高糖的環(huán)境會促使牙齦中TLR4的表達上調(diào)，在局部的炎癥環(huán)境中TLR4的表達增強還會促進糖尿病患者更容易患上牙周炎［18］。通過對S100A9、TLR4、p-P65在牙周膜、牙齦和牙槽骨中表達的半定量分析發(fā)現(xiàn)，在實驗組動物中三者的表達有明顯相似的趨勢，推測S100A9蛋白可能通過激活TLR4表達使牙槽骨的破骨性吸收加重。

本研究通過構(gòu)建糖尿病大鼠模型，研究糖尿病對牙周結(jié)構(gòu)的影響，并檢測牙周組織中S100A9蛋白的表達，以及TLR4和NF-κB/p-P65在牙周組織中的表達。本研究結(jié)果表明，S100A9可能通過激活TLR4的表達增強牙槽骨的破骨性骨吸收，同時通過激活NF-κB信號通路促進牙周炎癥的發(fā)生，本研究結(jié)果可為糖尿病導(dǎo)致的牙周病變的臨床治療提供藥物靶點，可能會為改善糖尿病導(dǎo)致的牙周病變提供新的治療靶點。

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（本文編輯杜冰）

Expression and effect of S100A9 in the periodontium of diabetic rats

Sun Wenhua1，2，3， Chen Guoqing2，3， Tian Weidong2，3. （1. College of Life Science， Sichuan University， Chengdu 610065， China； 2. State Key Laboratory of Oral Diseases， West China Hospital of Stomatology， Sichuan University， Chengdu 610041， China； 3. National Engineering Laboratory for Oral Regenerative Medicine， Sichuan University， Chengdu 610041， China）
Supported by: The National Natural Science Foundation of China （81271119）； Basic Research Program of Sichuan Province （2013JY0019）. Correspondence: Tian Weidong， E-mail: drtwd@sina.com.

ObjectiveThe study seeks to investigate the expression of S100A9 and its potential role in periodontal diseases induced by diabetes. MethodsA diabetic SD rat model was established through intraperitoneal injection of streptozotocin （STZ）. Hematoxylin-eosin （HE） staining was performed to study the structure of the periodontium of diabetic rats. Using immunohistochemical staining， the distribution of S100A9 expression was detected in the periodontium of diabetic rats. Expressions of Toll-like receptor 4 （TLR4） （ligands of S100A9） and p-P65/nuclear factor κB （NF-κB） were also measured. ResultsThe trabecular structure of alveolar bone was sparser， and lamina dura was disappeared in diabetic rats. Obviously higher expressions of S100A9 were observed in the periodontal ligament， alveolar bone， and gingival epithelial of diabetic rats than in the control rats. TLR4 expressions in the periodontal ligament， alveolar bone and gingival epithelial of the diabetic rats were also higher as compared to the control rats. p-P65 expression was not detected in the control rats， but was detected in the periodontal ligament and alveolar bone of the diabetic rats. ConclusionPeriodontium lesions in diabetes mellitus may be induced by the activation of TLR4 and NF-κB signaling pathway meditated by S100A9.

S100A9；periodontal lesion；diabetes；Toll-like receptor 4；nuclear factor κB

R 781.4

A

10.7518/hxkq.2016.04.020

2016-01-18；

2016-05-10

國家自然科學(xué)基金（81271119）；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（2013JY0019）

孫文華，碩士，E-mail:whsun91@163.com

田衛(wèi)東，教授，博士，E-mail:drtwd@sina.com