謝美蓮　余挺　卓穎　黃馨　謝寶儀　軒東英，3　章錦才，3

1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，廣州 510280；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，廣州 510150；3.中國科學(xué)院大學(xué)存濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬杭州口腔醫(yī)院牙周科，杭州 310006

·牙周病學(xué)專欄·

牙周局部炎癥影響小鼠腸道機(jī)械及免疫屏障功能

謝美蓮1余挺2卓穎1黃馨1謝寶儀1軒東英1，3章錦才1，3

1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，廣州 510280；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，廣州 510150；3.中國科學(xué)院大學(xué)存濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬杭州口腔醫(yī)院牙周科，杭州 310006

目的探索牙周局部炎癥對小鼠腸道屏障（生態(tài)屏障、機(jī)械屏障、免疫屏障）功能的影響。方法將20只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為牙周炎組（P組）和對照組（C組），每組10只。P組使用浸泡牙齦卟啉單胞菌的絲線行牙周結(jié)扎10 d，C組假性結(jié)扎。分離上頜骨測量牙槽骨喪失量，取腸道內(nèi)容物行16s rRNA焦磷酸測序分析菌群結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)檢測回腸組織occludin、claudin2、NOD2蛋白的表達(dá)。結(jié)果P組的牙槽骨喪失量高于C組（P＜0.001）。P組與C組的主要菌門及卟啉單胞菌種比例無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），P組occludin、claudin2、NOD2的表達(dá)高于C組（P=0.039，P=0.011，P=0.039）。結(jié)論牙周局部炎癥在一定程度上影響了小鼠腸道的機(jī)械及免疫屏障功能。

牙周炎；炎癥性腸病；腸道菌群；機(jī)械屏障

牙周炎是由菌斑微生物引發(fā)的以牙周支持組織破壞為主要特征的慢性炎癥性疾?。?］，是成年人失牙的主要原因［2］。流行病學(xué)資料顯示牙周炎與一系列全身系統(tǒng)性疾病包括胃腸道疾病如炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）等相關(guān)［3-5］。約旦流行病學(xué)調(diào)查顯示IBD人群的牙周炎患病率是非IBD人群的4.9～7.0倍［6］。IBD人群的牙周袋探診深度較非IBD人群高0.8～0.9 mm［7］。然而，牙周炎與胃腸道疾病的關(guān)聯(lián)機(jī)制并不清楚，菌群失調(diào)可能是其重要機(jī)制［8］。研究［9］發(fā)現(xiàn)口腔喂飼牙齦卟啉單胞菌（Porphy-romonas gingivalis，P. gingivalis）可導(dǎo)致小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)改變和腸道機(jī)械屏障受損，但未誘導(dǎo)出明確的牙周炎和牙周組織破壞［10］。至此仍無明確證據(jù)表明，牙周炎對腸道功能包括菌群結(jié)構(gòu)和腸道屏障有不利影響。本研究以結(jié)扎法誘導(dǎo)實(shí)驗性牙周炎，通過檢測牙周炎狀態(tài)下小鼠腸道的生態(tài)、機(jī)械及免疫屏障變化，探索牙周炎對小鼠腸道功能的影響，為牙周炎與腸道疾病的關(guān)聯(lián)機(jī)制提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1牙周炎模型的建立與驗證

1.1.1實(shí)驗性牙周炎模型建立將20只SPF級雄性C57BL/6J小鼠（22周齡，體重27.2 g± 2.5 g）隨機(jī)分為牙周炎組（P組）和對照組（C組），每組10只。4%水合氯醛腹腔注射麻醉下，P組使用浸泡P. gingivalis ATCC33277肉湯24 h的5-0絲線行雙側(cè)上頜第二磨牙（M2）牙周結(jié)扎，C組使用浸泡無菌水的5-0絲線行假性結(jié)扎。一次性結(jié)扎10 d后，處死小鼠取材。

1.1.2實(shí)驗性牙周炎模型驗證分離上頜骨，用10%中性甲醛溶液固定。取一側(cè)脫鈣液（10%EDTA，0.2 mol·L-1Tris）脫鈣3周，M2頰側(cè)正面朝下包埋，切5 μm厚切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。體視顯微鏡下拍照，定性分析牙周組織炎癥。另一側(cè)于沸水中煮15 min，剝凈軟組織、漂白，1%亞甲基藍(lán)水溶液染色1 min，沖洗、晾干，體視顯微鏡下拍照，Image J軟件（NIH公司，美國）測量3個磨牙頰腭側(cè)共18個位點(diǎn)的釉牙骨質(zhì)界-牙槽嵴頂距離［11］，均值為樣本的牙槽骨喪失量。

1.216s rRNA焦磷酸測序法檢測腸道菌群結(jié)構(gòu)

分離腸道的回腸至結(jié)腸部分［12］，5 mL生理鹽水沖取腸道內(nèi)容物，混勻，PowerSoil?DNA提取試劑盒（MO BIO公司，美國）提取總DNA，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。所得DNA進(jìn)行凝膠電泳，確認(rèn)DNA質(zhì)量合格。針對16s rRNA的V3、V4高變區(qū)序列設(shè)計特異性引物（V3，TACGGRAGGCAGCAG；V4，GGACTACCAGGGTATCTAAT），進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。擴(kuò)增程序設(shè)定為:95 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s、55 ℃15 s、72 ℃ 5 min 循環(huán)25次，72 ℃ 10 min。對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行提純，末端修復(fù)，連上接頭、測序引物后，采用Illumina Miseq高通量平臺測序，測序策略為PE 300。測序所得序列通過去除低質(zhì)量序列、接頭污染序列及含N比例大于5%序列等過程完成數(shù)據(jù)過濾，得到可信的目標(biāo)序列。目標(biāo)序列采用PEAR序列拼接算法將雙末端測序序列根據(jù)末尾的重疊情況進(jìn)行拼接，導(dǎo)入分析軟件QIIME 1.8.0進(jìn)行分析［13］。

1.3免疫組織化學(xué)檢測回腸組織occludin、claudin2、NOD2蛋白的表達(dá)

取長度為2 cm的回腸（距回盲端2 cm），4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，切4 μm厚切片。切片常規(guī)脫蠟、水化，微波熱抗原修復(fù)13 min（修復(fù)液1 mmol·L-1Tris-EDTA），冷卻后PBS緩沖液（0.01 mol·L-1，pH 7.2～7.4）沖洗，30 mL·L-1過氧化氫滅活15 min，10%山羊血清封閉10 min。37 ℃下孵育一抗（Abcam兔抗小鼠occludin、兔抗小鼠claudin2、大鼠抗小鼠NOD2一抗分別孵育2、2、3 h），PBS沖洗，37 ℃下孵育二抗30 min，PBS沖洗， DAB（工作濃度1∶20）顯色30 s，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片，Olympus IX83顯微鏡下鏡檢，Image Pro Express 6.0軟件拍照。每組隨機(jī)選取5個樣本，每個樣本隨機(jī)選取5個不連續(xù)切片上的5個視野（×400），利用ImagePro Plus 6.0軟件計算蛋白染色的平均光密度值。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述結(jié)果。牙槽骨喪失量、菌群比例以及平均光密度值均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗行兩組間比較。

2　結(jié)果

2.1實(shí)驗性牙周炎模型成功建立

頜骨HE染色（圖1上）顯示，P組牙齦退縮，上皮及上皮下結(jié)締組織大量炎癥細(xì)胞浸潤，C組牙周組織正常。亞甲基藍(lán)染色（圖1下）顯示，P組出現(xiàn)明顯的牙槽骨喪失。

圖1　實(shí)驗性牙周炎模型的驗證Fig　1　Verification of experiment periodontitis model

P、C組的牙槽骨喪失量分別為（0.38±0.06）、（0.15±0.02）mm，統(tǒng)計分析表明，P組的牙槽骨喪失量高于C組（P＜0.001）。

2.2腸道菌群結(jié)構(gòu)分析比較

本次測序腸道檢測出8個主要菌門:擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、候選菌門、疣微菌門、無壁菌門、脫鐵桿菌門，其中前5種菌門占測得序列的99.6%以上。聚類樹圖顯示組內(nèi)樣本一致性較好（圖2）。

圖2　各樣本腸道菌群結(jié)構(gòu)聚類樹圖Fig　2　Cluster dendrogram generated of the gut microbiota across the samples

2組主要菌門及卟啉單胞菌種比例的比較見表1。與C組相比，P組擬桿菌門、厚壁菌門、候選菌門、無壁菌門、脫鐵桿菌門比例下降，變形菌門、放線菌門、疣微菌門、卟啉單胞菌種比例升高，但均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。對于脫鐵桿菌門， C組檢出比例為0.05‰，P組未檢出，二者間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.3回腸組織中occludin、claudin2、NOD2蛋白的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果（圖3）顯示，occludin、claudin2均表達(dá)于回腸黏膜上皮細(xì)胞的胞漿，NOD2表達(dá)于上皮細(xì)胞及間質(zhì)單核巨噬細(xì)胞系的胞核。P組occludin、claudin2、NOD2的表達(dá)高于C組（P=0.039，P=0.011，P=0.039）（表2）。

表1　2組主要菌門及卟啉單胞菌種比例的比較Tab　1　Comparison of the abundance of the main phyla and genus parabacteroides of two groups

圖3　2組回腸組織occludin、claudin2及NOD2蛋白的表達(dá)　免疫組織化學(xué)　× 400Fig　3　Occludin， claudin2 and NOD2 in the ileum of two groups　immunohistochemistry　× 400

表2　2組回腸組織occludin、claudin2、NOD2蛋白表達(dá)的比較Tab　2　Comparison of occludin， claudin2 and NOD2 expression in ileum of two groups

3　討論

腸道屏障包括由腸道正常菌群組成的生態(tài)屏障、由完整上皮和各類緊密連接蛋白（如occludin、claudin2［14］）組成的機(jī)械屏障以及由腸道黏膜內(nèi)各類免疫細(xì)胞及免疫蛋白（如NOD2［15］）組成的免疫屏障，三者在功能上緊密聯(lián)系，共同行使腸道免疫功能［16］。本研究結(jié)果顯示，牙周炎組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)無顯著改變，但其機(jī)械屏障和免疫屏障發(fā)生了一定程度的變化。

在生態(tài)屏障方面，牙周局部炎癥對小鼠腸道菌群的菌門結(jié)構(gòu)及卟啉單胞菌種比例并無顯著影響。值得注意的是，盡管沒有顯著性，牙周炎小鼠的腸道未能檢測出脫鐵桿菌門的存在。Robertson等［17］認(rèn)為脫鐵桿菌門與人類健康或疾病狀態(tài)都沒有明確關(guān)聯(lián)。有趣的是，近年有研究［18］發(fā)現(xiàn)，脫鐵桿菌門在牙周炎患者的齦下菌群中的比例高于非牙周炎患者。脫鐵桿菌門也存在于感染牙髓中并被認(rèn)為可能是根尖周疾病的潛在病原菌［19］。此外，在肥胖小鼠、結(jié)腸炎小鼠以及被豬鞭蟲感染的小型豬的腸道中，均觀察到了脫鐵桿菌門比例的升高［20-22］。脫鐵桿菌門似乎傾向于在炎癥部位活躍，但卻在牙周炎小鼠的腸道中“缺席”，可能是菌群調(diào)控的結(jié)果。

在機(jī)械屏障方面，occludin是緊密連接蛋白中最早被發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)蛋白［23］。occludin與claudins家族共同組成轉(zhuǎn)運(yùn)通道，控制上皮屏障通透性，其過量表達(dá)時上皮通透性明顯增加［14］。Choi等［24］研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者的牙齦上皮出現(xiàn)occludin的過量表達(dá)；而claudin2的上調(diào)及其他claudins的改變被認(rèn)為與IBD的疾病活動期相關(guān)［25］。在本實(shí)驗中，牙周炎小鼠同時出現(xiàn)occludin和claudin2的表達(dá)上調(diào)，表明其腸道機(jī)械屏障功能受損。此外，claudin2的上調(diào)還伴隨著腸道上皮細(xì)胞對抗原大分子胞吞作用的增強(qiáng)［26］。NOD2在牙周炎小鼠的高表達(dá)驗證了這一點(diǎn)。

NOD2是胃腸道上皮細(xì)胞及髓系、淋巴系造血細(xì)胞內(nèi)的先天性免疫蛋白［27］，其可識別進(jìn)入胞內(nèi)的革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的胞壁肽聚糖，啟動對病原體的應(yīng)答反應(yīng)［15］。牙周炎小鼠腸道出現(xiàn)NOD2的高表達(dá)，說明腸道免疫屏障被激活，這可能是機(jī)械屏障受損的結(jié)果，也可能說明腸道正常菌群已經(jīng)發(fā)生了一定程度的變化。

本研究采用單次牙周結(jié)扎建立小鼠牙周炎模型，主要基于以下兩點(diǎn):1）多次麻醉將引起注射局部炎癥反應(yīng)［28］；牙周結(jié)扎時采用腹腔注射麻醉，多次結(jié)扎可能引起腹腔、腸道及系統(tǒng)的非特異性炎癥反應(yīng)，混淆本實(shí)驗結(jié)果。2）Nakajima團(tuán)隊的實(shí)驗中，在單次109CFU數(shù)量的活牙齦卟啉單胞菌管飼后的48 h可檢測到P組的卟啉單胞菌種比例顯著高于C組［9］，提示大量喂飼牙齦卟啉單胞菌可造成腸道菌群結(jié)構(gòu)改變；但即使是多次喂飼，實(shí)驗小鼠上也并沒有觀察到顯著的牙槽骨吸收［10］；因此，牙齦卟啉單胞菌喂飼不足以引起典型的牙周炎。單次結(jié)扎可最大限度地減少建模手段本身對系統(tǒng)性炎癥水平及腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的影響。本實(shí)驗因結(jié)扎使用的絲線含有牙齦卟啉單胞菌，盡管菌群檢測的結(jié)果顯示P組的卟啉單胞菌種比例并不顯著高于C組，但尚不能否認(rèn)本實(shí)驗的結(jié)果與牙齦卟啉單胞菌的吞菌無關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗結(jié)果尚不能說明牙周局部炎癥對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有顯著的調(diào)控，但在一定程度上影響了其腸道屏障功能，包括機(jī)械屏障受損以及免疫屏障激活，提示控制牙周疾病可能有利于預(yù)防和控制胃腸道疾病，但其相關(guān)的具體生理機(jī)制仍需深入研究和探討。

［1］ Hajishengallis G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation［J］. Nat Rev Immunol，2015， 15（1）:30-44.

［2］ 駱凱， 閆福華. 牙周病與全身健康［J］. 中國實(shí)用口腔科雜志， 2009， 2（4）:203-206. Luo K， Yan FH. Periodontal diseases and human health［J］. Chin J Pract Stomatol， 2009， 2（4）:203-206.

［3］朱習(xí)華， 劉麗， 許文青. 牙周病與糖尿病關(guān)聯(lián)性的Meta分析［J］. 廣東牙病防治， 2014， 22（2）:76-78. Zhu XH， Liu L， Xu WQ. Meta-analysis of the relationship between periodontitis and diabetes［J］. J Dent Prevent Treat，2014， 22（2）:76-78.

［4］ Gurav AN. The implication of periodontitis in vascular endothelial dysfunction［J］. Eur J Clin Invest， 2014， 44（10）:1000-1009.

［5］ Vavricka SR， Manser CN， Hediger S， et al. Periodontitis and gingivitis in inflammatory bowel disease: a case-controlstudy［J］. Inflamm Bowel Dis， 2013， 19（13）:2768-2777.

［6］ Habashneh RA， Khader YS， Alhumouz MK， et al. The association between inflammatory bowel disease and periodontitis among Jordanians: a case-control study［J］. J Periodont Res， 2012， 47（3）:293-298.

［7］ Brito F， de Barros FC， Zaltman C， et al. Prevalence of periodontitis and DMFT index in patients with Crohn's disease and ulcerative colitis［J］. J Clin Periodontol， 2008， 35（6）: 555-560.

［8］ Chassaing B， Gewirtz AT. Gut microbiota， low-grade inflammation， and metabolic syndrome［J］. Toxicol Pathol，2014， 42（1）:49-53.

［9］ Nakajima M， Arimatsu K， Kato T， et al. Oral administration of P. gingivalis induces dysbiosis of gut microbiota and impaired barrier function leading to dissemination of enterobacteria to the liver［J］. PLoS One， 2015， 10（7）:e0134234.

［10］ Arimatsu K， Yamada H， Miyazawa H， et al. Oral pathobiont induces systemic inflammation and metabolic changes associated with alteration of gut microbiota［J］. Sci Rep， 2014，4:4828.

［11］ Kimura S， Nagai A， Onitsuka T， et al. Induction of experimental periodontitis in mice with Porphyromonas gingivalisadhered ligatures［J］. J Periodontol， 2000， 71（7）:1167-1173.

［12］ Belzer C， Gerber GK， Roeselers G， et al. Dynamics of the microbiota in response to host infection［J］. PLoS One， 2014，9（7）:e95534.

［13］ Quast C， Pruesse E， Yilmaz P， et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools［J］. Nucleic Acids Res， 2013， 41（Database issue）:D590-D596.

［14］ Anderson JM， Van Itallie CM. Tight junctions and the molecular basis for regulation of paracellular permeability［J］. Am J Physiol， 1995， 269（4 Pt 1）:G467-G475.

［15］ Barnich N， Aguirre JE， Reinecker HC， et al. Membrane recruitment of NOD2 in intestinal epithelial cells is essential for nuclear factor-κB activation in muramyl dipeptide recognition［J］. J Cell Biol， 2005， 170（1）:21-26.

［16］ Zhang K， Hornef MW， Dupont A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity［J］. Cell Microbiol， 2015，17（11）:1561-1569.

［17］ Robertson BR， O'Rourke JL， Neilan BA， et al. Mucispirillum schaedleri gen. nov.， sp. nov.， a spiral-shaped bacterium colonizing the mucus layer of the gastrointestinal tract of laboratory rodents［J］. Int J Syst Evol Microbiol， 2005， 55 （Pt 3）:1199-1204.

［18］ Kumar PS， Griffen AL， Barton JA， et al. New bacterial species associated with chronic periodontitis［J］. J Dent Res，2003， 82（5）:338-344.

［19］ Siqueira JF， Rocas IN， Cunha CD， et al. Novel bacterial phylotypes in endodontic infections［J］. J Dent Res， 2005 （6）:565-569.

［20］ Walker A， Pfitzner B， Neschen S， et al. Distinct signatures of host-microbial meta-metabolome and gut microbiome in two C57BL/6 strains under high-fat diet［J］. ISME J， 2014，8（12）:2380-2396.

［21］ Li RW， Wu S， Li W， et al. Alterations in the porcine colon microbiota induced by the gastrointestinal nematode Trichuris suis［J］. Infect Immun， 2012， 80（6）:2150-2157.

［22］ Berry D， Schwab C， Milinovich G， et al. Phylotype-level 16S rRNA analysis reveals new bacterial indicators of health state in acute murine colitis［J］. ISME J， 2012， 6（11）:2091-2106.

［23］ Furuse M， Hirase T， Itoh M， et al. Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions［J］. J Cell Biol，1993， 123（6 Pt 2）:1777-1788.

［24］ Choi YS， Kim YC， Ji S， et al. Increased bacterial invasion and differential expression of tight-junction proteins， growth factors， and growth factor receptors in periodontal lesions［J］. J Periodontol， 2014， 85（8）:e313-e322.

［25］ Zeissig S， Burgel N， Gunzel D， et al. Changes in expression and distribution of claudin 2， 5 and 8 lead to discontinuous tight junctions and barrier dysfunction in active Crohn's disease［J］. Gut， 2007， 56（1）:61-72.

［26］ Luettig J， Rosenthal R， Barmeyer C， et al. Claudin-2 as a mediator of leaky gut barrier during intestinal inflammation ［J］. Tissue Barriers， 2015， 3（1/2）:e977176.

［27］ Girardin SE， Boneca IG， Viala J， et al. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide （MDP）detection［J］. J Biol Chem， 2003， 278（11）:8869-8872.

［28］ Lisowska B， Szymańska M， Nowacka E， et al. Anesthesiology and the cytokine network［J］. Postepy Hig Med Dosw （Online）， 2013， 67:761-769.

（本文編輯李彩）

Periodontal inflammation affects the mechanical and immune barrier functions of mice gut

Xie Meilian1， Yu Ting2，Zhuo Ying1， Huang Xin1， Xie Baoyi1， Xuan Dongying1，3， Zhang Jincai1，3.（1. Dept. of Periodontology， The Affiliated Hospital of Stomatology， Southern Medical University， Guangzhou 510280， China； 2. Dept. of Periodontology， The Affiliated Hospital of Stomatology， Guangzhou Medical University， Guangzhou 510150， China； 3. Dept. of Periodontology， Hangzhou Dental Hospital， Savaid Medical School， University of Chinese Academy of Sciences， Hangzhou 310006， China）
Supported by: The National Natural Science Foundation of China （81271160， 81371151， 81470750）. Correspondence: Zhang Jincai， E-mail: jincaizhang@live.cn.

ObjectiveTo explore the effects of periodontal inflammation on the functions of gut barrier （ecological barrier，mechanical barrier， and immune barrier） in mice. MethodsTwenty male C57BL/6J mice were randomly divided into periodontitis （P） or control （C） groups. The P group was subjected under a 10-day ligation with Porphyromonas gingivalis to induce periodontitis， whereas the C group was ligated with sham. Maxillae were obtained to assess alveolar bone loss. The phylogenetic structure and diversity of microbial communities in the gut were analyzed by 16s rRNA pyrosequencing. Immunohistochemical analysis was performed to determine the expressions of occludin， claudin2， and NOD2 in the ileum. ResultsCompared with the C group， the P group displayed significant alveolar bone loss （P＜0.001）. In addition， no significant influence on the main phyla and genus Parabacteroides of the two groups was observed （P＞0.05）. However， the ileum of the P group showed significantly upregulated occludin， claudin2， and NOD2 （P=0.039， P=0.011， and P=0.039， respectively）. Conclusion Periodontal inflammation influences to some extent the mechanical and immune barrier functions of the mice gut.

periodontitis；inflammatory bowel diseases；gut microbiota；mechanical barrier

R 781.4

A

10.7518/hxkq.2016.04.019

2015-12-16；

2016-03-18

國家自然科學(xué)基金（81271160，81371151，81470750）

謝美蓮，碩士，E-mail:nymphaea468@126.com

章錦才，教授，博士，E-mail:jincaizhang@live.cn