陳占偉　孫杜斌　黃圣運(yùn)　吳海威　張東升

1.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院口腔頜面外科，濟(jì)南 250021；2.鄒城市人民醫(yī)院口腔科，濟(jì)寧 273500

涎腺腺樣囊性癌中BNIP3蛋白的表達(dá)及臨床意義分析

陳占偉1孫杜斌2黃圣運(yùn)1吳海威1張東升1

1.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院口腔頜面外科，濟(jì)南 250021；2.鄒城市人民醫(yī)院口腔科，濟(jì)寧 273500

目的研究促凋亡蛋白BNIP3在涎腺腺樣囊性癌（SACC）中的表達(dá)以及與臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系，探討其在腺樣囊性癌低氧自噬中的作用。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)65例SACC患者中BNIP3、低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α和LC3的蛋白表達(dá)，分析BNIP3表達(dá)與SACC臨床病理特征之間的關(guān)系及其與HIF-1α、LC3表達(dá)的相關(guān)性，并對(duì)患者生存率進(jìn)行單因素生存分析。結(jié)果BNIP3在41例SACC中陽(yáng)性表達(dá)（63.1%），其表達(dá)的高低與組織學(xué)分級(jí)相關(guān)（P=0.001）。BNIP3與HIF-1α的表達(dá)相關(guān)（P=0.011），與LC3的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性（P=0.167）。BNIP3陰性表達(dá)組的總體存活率高于BNIP3陽(yáng)性表達(dá)組（P＜0.05）。結(jié)論BNIP3在SACC的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用，為SACC的基因靶向治療提供了新的治療方向。

腺樣囊性癌；BNIP3蛋白；低氧；低氧誘導(dǎo)因子；自噬

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carci-noma，SACC）是惡性唾液腺腫瘤中的常見(jiàn)類(lèi)型，約占所有唾液腺腫瘤的10%，占所有惡性唾液腺腫瘤中的22%［1］。現(xiàn)階段對(duì)于腺樣囊性癌的治療方案主要是以根治手術(shù)為主，同時(shí)輔以放療的綜合序列治療，但腺樣囊性癌的總體療效仍不能讓人滿(mǎn)意。

低氧作為實(shí)體腫瘤微環(huán)境中常見(jiàn)的現(xiàn)象，對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及血管生成有重要的作用。低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1是在低氧條件下重要的轉(zhuǎn)錄因子，其中HIF-1α是HIF-1的功能亞基，已經(jīng)在多數(shù)癌癥中觀察到，并與不良預(yù)后及治療抵抗相關(guān)［2-3］。既往研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在涎腺腺樣囊性癌中廣泛表達(dá)，而在腫瘤附近正常涎腺腺體組織中鮮有表達(dá)。BNIP3，即Bcl2/腺病毒E1B相對(duì)分子質(zhì)量為19×103的相關(guān)蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19×103interacting protein 3），屬于促凋亡蛋白，其表達(dá)受HIF-1α依賴(lài)的缺氧的調(diào)節(jié)及其他很多因素的影響。BNIP3蛋白主要定位于線(xiàn)粒體外膜，當(dāng)其被激活后，完全整合入線(xiàn)粒體外膜，通過(guò)開(kāi)放線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔損傷線(xiàn)粒體功能引起染色質(zhì)凝聚、DNA分解，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。BNIP3的異常表達(dá)和很多腫瘤的進(jìn)展、化療耐藥及自噬密切相關(guān)。BNIP3的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的調(diào)控，在低氧誘導(dǎo)細(xì)胞自噬凋亡過(guò)程中起重要的作用。然而，涎腺腺樣囊性癌中BNIP3蛋白的表達(dá)及其調(diào)節(jié)的低氧誘導(dǎo)自噬通路和臨床病理學(xué)行為尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)腺樣囊性癌組織和細(xì)胞中BNIP3以及低氧相關(guān)蛋白HIF-1α和自噬相關(guān)蛋白LC3的檢測(cè)，探索其在腺樣囊性癌低氧自噬中的作用，同時(shí)分析BNIP3的表達(dá)在腺樣囊性癌研究中的臨床意義，為腺樣囊性癌的基因靶向治療尋找新的治療方向。

1　材料和方法

1.1研究對(duì)象

對(duì)2002—2011年期間于山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院口腔頜面外科進(jìn)行腫瘤切除手術(shù)的65例涎腺腺樣囊性癌病例（所有病例術(shù)前均未進(jìn)行放射治療或者化療）進(jìn)行整理回顧，所選病理標(biāo)本均由山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院病理科病理證實(shí)為腺樣囊性癌，所有患者臨床病理資料及術(shù)后隨訪資料完整。65例患者中，女性26例，男性39例，平均年齡48.2歲（18～75歲）。腫瘤平均大小1.9 cm（0.6～4.5 cm）。根據(jù)美國(guó)聯(lián)合癌癥分類(lèi)委員會(huì)制定的最新腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腫瘤進(jìn)行臨床TNM分期。組織學(xué)分級(jí)為:Ⅰ級(jí)，腫瘤中主要為管狀型和（或）篩孔型兩種病理類(lèi)型，無(wú)實(shí)體型存在；Ⅱ級(jí)，腫瘤中存在管狀型和（或）篩孔型，但實(shí)體型成分小于等于30%；Ⅲ級(jí)，腫瘤中管狀型和篩孔型較少見(jiàn)，以實(shí)體型為主［4］。

1.2免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腺樣囊性癌中BNIP3、HIF-1α和LC3的蛋白表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)EnvisionTM二步法，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，一抗為鼠抗人BNIP3單克隆抗體（1∶100，Santa Cruz公司，美國(guó)）、兔抗人LC3A/ B多克隆抗體（1∶200，Abcam公司，英國(guó)）、兔抗人HIF-1α多克隆抗體（1∶50，武漢博士德生物工程有限公司），二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔的二抗、DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。4 μm厚白片經(jīng)脫蠟水化后，其中BNIP3、LC3應(yīng)用枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）、HIF-1α應(yīng)用EDTA（pH 9.0）高壓水浴加熱，進(jìn)行抗原修復(fù)20 min，室溫冷卻后，滴加3%過(guò)氧化氫溫箱孵育30 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS沖洗，滴加一抗，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；次日提前1 h取出復(fù)溫，PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗5 min×3 次；DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精襯染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。用PBS取代一抗作為空白對(duì)照。

判斷標(biāo)準(zhǔn):BNIP3的表達(dá)一般定位于胞漿內(nèi)，而HIF-1α和LC3可同時(shí)表達(dá)于細(xì)胞胞漿或者細(xì)胞核內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)僅評(píng)價(jià)細(xì)胞核內(nèi)HIF-1α的表達(dá)以及細(xì)胞漿內(nèi)LC3的表達(dá)。參考現(xiàn)有免疫評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)整個(gè)切片中陽(yáng)性的強(qiáng)度和面積對(duì)每例病例進(jìn)行評(píng)分，陽(yáng)性強(qiáng)度分為無(wú)（0分）、弱（1分）、中（2分）、強(qiáng)（3分）4個(gè)級(jí)別，陽(yáng)性面積分為＜10%（0分）、10%～49%（1分）、≥50%（2分）。對(duì)于HIF-1α的評(píng)估，由于其核染色的特殊性，將陽(yáng)性表達(dá)率小于30%視為陰性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率大于等于30%視為陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果評(píng)判由2名醫(yī)師進(jìn)行雙盲讀片確定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用Pearson χ2檢驗(yàn)或連續(xù)矯正的χ2檢驗(yàn)對(duì)SACC組織中BNIP3表達(dá)與患者的臨床病理特征參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行比較，對(duì)BNIP3與HIF-1α、LC3表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析。采用Kaplan-Meier法對(duì)患者生存率進(jìn)行單因素生存分析，差異顯著性采用Log-Rank檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1BNIP3在腺樣囊性癌中的表達(dá)以及與臨床病理特征的關(guān)系

BNIP3在正常唾液腺細(xì)胞中呈陰性表達(dá)，而在SACC 3種不同的組織病理類(lèi)型（篩孔、管狀和實(shí)體型）中均可觀察到BNIP3的陽(yáng)性表達(dá)（圖1）。BNIP3 在65例腺樣囊性癌中有41例陽(yáng)性表達(dá)（63.1%），其表達(dá)的高低與組織學(xué)分級(jí)相關(guān)（P=0.001），而與年齡、性別、TNM分期、腫瘤大小和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性（表1）。

圖1　BNIP3的表達(dá)　免疫組織化學(xué)染色　× 200Fig　1　The expression of BNIP3　immunohistochemical staining　× 200

表1　BNIP3與腺樣囊性癌臨床病理特征之間的關(guān)系Tab　1　Correlation between BNIP3 expression and the clinicopathologic variables in SACC

2.2BNIP3與HIF-1α、LC3表達(dá)的相關(guān)性

BNIP3與HIF-1α、LC3的表達(dá)相關(guān)性見(jiàn)表2、3。BNIP3與HIF-1α的表達(dá)相關(guān)（P=0.011），與LC3的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性（P=0.167）。

表2　BNIP3與HIF-1α的表達(dá)相關(guān)性Tab　2　Correlation between BNIP3 and HIF-1α expression in SACC

2.3生存率分析

65例患者平均隨訪時(shí)間為63個(gè)月（18～115個(gè)月），30例患者死于本病，33例患者仍然存活，2例失訪。Kaplan-Meier法和Log-Rank檢驗(yàn)結(jié)果表明，BNIP3陰性表達(dá)組的總體存活率高于BNIP3陽(yáng)性表達(dá)組（P＜0.05）（圖2）。

表3　BNIP與LC3的表達(dá)相關(guān)性Tab　3　Correlation between BNIP3 and LC3 expression in SACC

圖2　Kaplan-Meier法分析BNIP3陰性與陽(yáng)性表達(dá)組腺樣囊性癌患者的生存率曲線(xiàn)Fig　2　Kaplan-Meier survival estimate for cumulative survival rate of patients with SACC according to BNIP3 negative and positive expression

3　討論

BNIP3是Bcl-2家族的促凋亡成員，可以與其他Bcl-2家族促凋亡成員相互作用。BNIP3含有多個(gè)結(jié)構(gòu)功能域，其中發(fā)揮重要功能作用的就是BH3域，BNIP3可以通過(guò)BH3域與其他蛋白發(fā)生交互作用。BNIP3已經(jīng)被證實(shí)是低氧狀態(tài)細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界壓力的重要作用基因。BNIP3的啟動(dòng)子含有一個(gè)缺氧反應(yīng)元件，而該結(jié)構(gòu)是HIF-1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的重要靶點(diǎn)，因此BNIP3被視為HIF-1α調(diào)節(jié)的重要下游基因。目前關(guān)于BNIP3是原癌基因還是抑癌基因的爭(zhēng)論很多。研究表明，BNIP3在胰腺癌［5］、結(jié)腸直腸癌和胃癌［6］、造血惡性腫瘤［7］中低表達(dá)而在非小細(xì)胞肺癌［8］、基底細(xì)胞癌［9］、膽管癌［10］中高表達(dá)。學(xué)者［11］指出，BNIP3可在乳腺癌誘發(fā)進(jìn)展過(guò)程中的不同階段發(fā)揮完全相反的作用。雖然在人體多種惡性腫瘤中均有研究，但是對(duì)于BNIP3在涎腺腺樣囊性癌中的角色認(rèn)識(shí)仍然十分有限。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BNIP3在正常唾液腺組織中呈陰性表達(dá)，而在SACC 3種不同病理類(lèi)型中呈陽(yáng)性表達(dá)，且與組織病理學(xué)分級(jí)相關(guān)。組織學(xué)Ⅲ級(jí)、細(xì)胞分化差的腫瘤組織中，BNIP3的表達(dá)顯著高于細(xì)胞分化較好的組織學(xué)Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)。另外，BNIP3陰性表達(dá)組的總體存活率比BNIP3陽(yáng)性表達(dá)組更高。這一特點(diǎn)與腫瘤的惡性程度一致，提示BNIP3在腺樣囊性癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)也探究了HIF-1α與LC3在腺樣囊性癌中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腺樣囊性癌細(xì)胞中HIF-1α/ BNIP3通路調(diào)節(jié)的低氧自噬可能在腺樣囊性癌中發(fā)揮著重要作用。本課題前期體外實(shí)驗(yàn)中通過(guò)模擬低氧狀態(tài)刺激腺樣囊性癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中HIF-1α/ BNIP3通路活性明顯上調(diào)，并且細(xì)胞自噬水平也明顯提高，這表明BNIP3可能在腺樣囊性癌的低氧自噬中有重要作用。然而，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)BNIP3的表達(dá)與LC3的表達(dá)并不相關(guān)。事實(shí)上，本研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)自噬的通路十分復(fù)雜，不同缺氧調(diào)節(jié)下調(diào)節(jié)低氧自噬的信號(hào)通路也不相同，一般來(lái)說(shuō)當(dāng)細(xì)胞處于極度缺氧條件下，除上述依賴(lài)HIF-1α/BNIP3信號(hào)通路調(diào)節(jié)活化的低氧自噬外，非HIF-1α依賴(lài)的低氧自噬通路也起著十分關(guān)鍵的作用。通過(guò)對(duì)極度低氧狀態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，在極度低氧甚至乏氧狀態(tài)下AMPK信號(hào)通路和UPR信號(hào)通路的活化可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［12］。因此，筆者推測(cè)在腺樣囊性癌組織中的不同部位低氧環(huán)境不同從而導(dǎo)致不同的信號(hào)通路活化，這也就解釋了為什么在腺樣囊性癌組織中BNIP3和LC3表達(dá)不相關(guān)的原因。

綜上所述，BNIP3可能在涎腺腺樣囊性癌的誘發(fā)進(jìn)展過(guò)程中扮演重要的角色，而且BNIP3可能成為腺樣囊性癌的一個(gè)新的預(yù)后因子，作為一種新的腺樣囊性癌腫瘤標(biāo)記物在未來(lái)的生物治療中起到重要作用。

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（本文編輯李彩）

Analysis of BNIP3 expression and clinical research in salivary adenoid cystic carcinoma

Chen Zhanwei1， Sun Dubin2，Huang Shengyun1， Wu Haiwei1， Zhang Dongsheng1.（1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250021， China； 2. Dept. of Stomatology， The People's Hospital of Zoucheng City， Jining 273500， China）
Supported by: The Natural Science Foundation of Shandong Province （ZR2012HQ022）. Correspondence: Zhang Dongsheng，E-mail: ds63zhang@163.com.

ObjectiveThis study investigated the expression of BNIP3 in salivary adenoid cystic carcinoma （SACC） and its correlations to the clinicopathological features and prognosis of patients with SACC. The role of BNIP3 in the progress of hypoxia-induced autophagy was elucidated. MethodsThe expression levels of BNIP3， hypoxia inducible factor （HIF）-1α，and LC3 in 65 SACC cases were detected by immunohistochemical staining method， and the correlation between the expression of BNIP3 and the clinicopathological features in SACC was analyzed. In addition， the correlations of BNIP3 gene expression with HIF-1α and LC3 gene expression were analyzed. The survival rate of patients with SACC was evaluated by univariate survival analysis. ResultsBNIP3 was considerably expressed in SACC in all three histological patterns， and was positive in 41 cases （63.1%）. BNIP3 gene expression was significantly correlated with histological grade （P=0.001） and HIF-1α gene expression （P=0.011）. By contrast， BNIP3 gene expression was not significantly correlated with LC3 gene expression （P= 0.167）. The overall survival rate of patients with negative BNIP3 expression was better than that of patients with positive BNIP3 expression （P＜0.05）. ConclusionBNIP3 might play a vital role in the tumorigenesis of SACC and may be a new target for gene therapy.

adenoid cystic carcinoma；BNIP3；hypoxia；hypoxia inducible factor；autophagy

R 739.81

A

10.7518/hxkq.2016.04.017

2015-11-16；

2016-01-18

山東省自然科學(xué)基金（ZR2012HQ022）

陳占偉，主治醫(yī)師，博士，E-mail:chzhanwei@126.com

張東升，教授，博士，E-mail:ds63zhang@163.com