王麗萍　李伯琦　王琪　鐵曉敏　劉奕杉

新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒童口腔科-口腔預防科，烏魯木齊 830000

無翅型MMTV整合位點家族成員5A/受體酪氨酸激酶樣孤兒受體2在大鼠牙囊細胞中的表達及其意義

王麗萍李伯琦王琪鐵曉敏劉奕杉

新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒童口腔科-口腔預防科，烏魯木齊 830000

目的觀察在牙齒正常萌出過程中無翅型MMTV整合位點家族成員5A（Wnt5A）/受體酪氨酸激酶樣孤兒受體2（Ror2）信號在大鼠體內(nèi)外牙囊細胞表達的特點，探討其與成熟破骨細胞形成及牙齒萌出的相關(guān)性。方法分離出生后1～13 d的SD大鼠下頜骨，蘇木精-伊紅染色觀察牙囊及牙槽骨生長發(fā)育過程，免疫組織化學法觀察在下頜第一磨牙萌出過程中Wnt5A和Ror2在牙囊細胞中的表達。體外培養(yǎng)出生后5～6 d的SD大鼠第一磨牙牙囊細胞，免疫組織化學法觀察Wnt5A、Ror2在牙囊細胞中的表達。結(jié)果SD大鼠出生后第2天牙囊開始分化為牙周組織，1～3 d牙槽骨變化不明顯，第4天起，破骨細胞數(shù)量明顯增多。Wnt5A在出生后第1～3天的大鼠牙囊組織內(nèi)無明顯表達，第4天開始出現(xiàn)陽性表達，并持續(xù)表達至第13天。Ror2在出生后第1～3天的大鼠牙囊組織表達呈強陽性，而在第4～13天呈弱陽性。結(jié)論Wnt5A、Ror2在牙萌出過程中有特定的時間分布，提示其可能參與牙齒萌出的調(diào)控。

無翅型MMTV整合位點家族成員5A；受體酪氨酸激酶樣孤兒受體2；牙囊；破骨細胞

無翅型MMTV整合位點家族成員（wingless-type MMTV integration site family member，Wnt）是一類對生長發(fā)育和生理病理過程有著重要作用的蛋白。無翅型MMTV整合位點家族成員5A（wingless-type MMTV integration site family，member 5A，Wnt5A）是Wnt家族中重要成員之一，也是激活非經(jīng)典Wnt信號通路的重要蛋白，主要功能是參與細胞間的信號傳遞［1］。

受體酪氨酸激酶樣孤兒受體2（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2，Ror2）是酪氨酸激酶受體家族中的重要成員之一，其在骨骼分化、組織細胞遷移及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等方面都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［2］。Nishita等［3］研究顯示，Ror2對Wnt5A信號通路的激活具有特異性。

近年來，口腔醫(yī)學領(lǐng)域?qū)nt5A的研究逐步深入，包括牙齒的生長發(fā)育、頜面部畸形、口腔腫瘤、牙周炎等［4-6］。Maeda等［7］發(fā)現(xiàn)Wnt5A-Ror2信號途徑在成骨細胞譜系細胞向破骨細胞前體轉(zhuǎn)化過程中促進破骨細胞發(fā)生，為原發(fā)性萌出異常等疾病提供治療方向。本研究擬用SD大鼠作為研究對象，初步探討Wnt5A/Ror2信號通路在牙齒萌出過程中的作用。

1　材料和方法

1.1主要試劑和儀器

胎牛血清（HyClone公司，澳洲），DMEM、胰蛋白酶（HyClone公司，美國），Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國），兔抗Wnt5A抗體（ThermoFisher公司，美國），兔抗Ror2抗體、二步法免疫組化檢測系統(tǒng)、DAB染色液、抗體稀釋液、進口羊血清、進口脫鈣液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），倒置顯微鏡、正置顯微鏡（萊卡公司，德國）。

1.2蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色

取出生后1～13 d齡的SD仔鼠各3只（雌雄、體質(zhì)不限，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供正常飼養(yǎng)），引頸處死，取出下頜骨，截取第一磨牙牙胚段，置入4%多聚甲醛溶液4 ℃固定24 h，再置入脫鈣液4 ℃下脫礦1～3周不等，不同梯度乙醇脫水，石蠟包埋，并分別制作4 μm厚的石蠟切片各6張。

1.3免疫組織化學染色

1.3.1組織切片分別取出生后1～13 d齡的組織切片各3張作為實驗組。65 ℃烤片2 h，常規(guī)脫蠟至水；滴加3%H2O2溶液，滅活內(nèi)源性酶；置于0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液，微波抗原修復12 min；滴加血清封閉液，室溫20 min；實驗組滴加兔抗大鼠Wnt5A一抗，4 ℃過夜；滴加生物素化兔抗山羊IgG，37 ℃溫箱25 min；DAB顯色2～3 min，蒸餾水洗滌；蘇木素復染；脫水透明，中性樹膠封片，正置顯微鏡下觀察。陰性對照組以PBS代替一抗，滴加在出生后9 d的組織切片上，其余處理同實驗組。Ror2的表達檢測同Wnt5A。

1.3.2牙囊細胞參考凌均棨等［8］的方法，分離5～6 d SD大鼠下頜第一磨牙胚，獲取牙囊組織并培養(yǎng)牙囊細胞，選取鋪滿培養(yǎng)皿60%～70%的P3代牙囊細胞，PBS沖洗3遍，4 ℃溫度下用4%多聚甲醛固定20 min，含0.5%Triton X-100是室溫下透化5～10 min，滴加血清封閉液37 ℃溫箱30 min；實驗組滴加兔抗大鼠Wnt5A一抗，對照組滴加等量PBS，4 ℃過夜；滴加生物素化兔抗山羊IgG，37 ℃溫箱25 min；DAB顯色，顯微鏡下觀察終止。Ror2的表達檢測同Wnt5A。

1.3.3結(jié)果判定陽性表達呈黃色至棕褐色顆粒，按有無表達和染色深淺程度，分為陰性、弱陽性、陽性、強陽性。陰性無表達，弱陽性為淺黃色或淺棕色，強陽性呈深黃或棕褐色。

2　結(jié)果

2.1下頜第一磨牙萌出過程中牙齒和牙周的形態(tài)學變化

牙齒萌出過程中下頜第一磨牙的形態(tài)學改變見圖1。

圖1　牙齒萌出過程中下頜第一磨牙的形態(tài)學改變　HE　× 50Fig　1　Morphological changes of the mandibular first molar in the process of tooth eruption　HE　× 50

由圖1可見，出生第1天的大鼠，下頜第一磨牙周圍可見幼稚的多層牙囊細胞；第2天開始，可見牙囊細胞分化為牙周組織；第7天可見牙周纖維明顯增多，牙囊細胞層次減少，多核的破骨細胞呈粉紅色，胞核內(nèi)含1～2個核仁，胞核呈淺藍色，細胞質(zhì)內(nèi)還可見大小不等的空泡。1～13 d牙槽骨中可觀察到破骨細胞持續(xù)出現(xiàn)，但出生后第3天和第9天可見破骨細胞數(shù)量相對較多。

2.2Wnt5A在大鼠下頜第一磨牙牙囊中的表達

Wnt5A在出生后第1～3天的大鼠牙囊組織中無表達；在出生后第4天，可見牙囊組織呈黃褐色，提示W(wǎng)nt5A表達（圖2）；在出生后第4～13天，Wnt5A在牙囊組織中持續(xù)表達陽性。P3代牙囊細胞Wnt5A免疫組織化學染色陽性表達（圖3），與組織切片相吻合。

2.3Ror2在大鼠下頜第一磨牙牙囊中的表達

Ror2在出生后第1～3天的大鼠牙囊組織中呈強陽性表達；在出生后第4～13天，Ror2在牙囊組織中呈弱陽性表達（圖4）；P3代牙囊細胞Ror2呈弱陽性，與組織切片相吻合（圖3）。

圖2　Wnt5A在牙齒萌出過程中的表達　IHC　× 200Fig　2　The expression of Wnt5A in the process of tooth eruption　IHC　× 200

圖3　牙囊細胞（P3代）Wnt5A、Ror2表達呈陽性　IHC　× 100Fig　3　The expression of Wnt5A and Ror2 in dental follicle cells （P3） was positive　IHC　× 100

圖4　Ror2在牙齒萌出過程中的表達　IHC　× 200Fig　4　The expression of Ror2 in the process of tooth eruption　IHC　× 200

3　討論

牙齒早萌或遲萌，如誕生牙和恒牙異位早萌、乳牙滯留和恒牙遲萌是錯畸形的常見病因之一，影響恒牙正常排列及正常建立，嚴重影響患者正?？谇簧砉δ?、顏面部美觀和心理健康。目前牙齒早萌或遲萌分子機制不清楚，可能涉及兩大方面:第一，牙槽骨或乳牙牙根吸收不協(xié)調(diào)；第二，牙齒萌出動力不足，涉及恒牙胚牙周膜、根尖組織、牙髓及牙囊發(fā)育等多因素的相互作用［9］。解決牙齒早萌或遲萌的重要前提是弄清牙齒正常萌出的分子機制。牙槽骨吸收形成萌出通道是牙齒萌出的必要前提條件［10］，該生理過程與破骨前體細胞分化為成熟破骨細胞密切相關(guān)。成熟破骨細胞則是牙槽骨吸收的執(zhí)行細胞。然而，牙齒萌出過程中啟動牙囊內(nèi)破骨前體細胞分化為成熟破骨細胞的關(guān)鍵信號分子不明確。為弄清牙齒萌出機制，關(guān)鍵科學問題之一就在于明確牙囊內(nèi)破骨前體細胞如何分化為成熟破骨細胞的分子機制。

破骨細胞從起源發(fā)育至成熟，再經(jīng)活化發(fā)揮吸收作用是一個復雜的多級調(diào)控過程，始終都受到一系列細胞因子的影響。有些細胞因子對破骨細胞的成熟分化起促進作用，如核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、1，25-（OH）2D3、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）等，其中RANKL 和M-CSF是破骨細胞形成和分化過程中兩個必需的因子；有些因子起抑制作用，如骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、IL-4、IL-10、雌激素、降鈣素、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等。OPG/核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/RANKL系統(tǒng)在破骨細胞分化成熟過程中起著樞紐作用，大部分細胞因子都直接或間接地通過OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)來發(fā)揮作用。介導破骨細胞分化成熟的各種細胞因子反應的信號傳導路徑主要包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin，CN）/活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）、活化T細胞核因子1（nuclear factor of activated T-cells，cytplasmic 1，NFATc1）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）等通路［11］，全面地了解破骨細胞因子及其信號傳導通路，將有助于臨床更好地分析牙齒早萌或遲萌等各種骨代謝性疾病的病因及發(fā)病機制，進而為治療提供理論依據(jù)。

Wnt5A/Ror2信號通路被認為在腫瘤，特別是骨肉瘤、前列腺癌等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、預后等中發(fā)揮重要作用［12-16］。關(guān)于Wnt5A對骨質(zhì)疏松這方面的影響，很多人考慮是其對成骨細胞的抑制，而骨的形成是成骨細胞和破骨細胞的調(diào)節(jié)作用，Maeda等［7］研究發(fā)現(xiàn)成骨細胞系細胞和破骨細胞前體表達Wnt5A 和Ror2，Ror2信號在破骨細胞前體高表達，并且增強RANKL的表達進而促進破骨細胞的形成。Wnt5A促進RANKL誘導破骨細胞形成。楊婷［5］研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞中的Wnt5A/Ror2信號可上調(diào)RANKL的表達，RANKL與RANK結(jié)合后可激活破骨前體細胞中的Ca2+/NFAT通路，促進破骨細胞的形成。

本實驗中通過HE染色方法，觀察到SD大鼠出生后1～13 d破骨細胞持續(xù)出現(xiàn)，在出生后第3天與第9天均有明顯的增加，這與Wise等［17］的研究結(jié)果相一致。通過免疫組織化學方法，觀察到Wnt5A、Ror2在牙萌出過程中有特定的時間分布，二者的變化與成熟破骨細胞的形成相吻合，提示W(wǎng)nt5A、Ror2是牙齒萌出的調(diào)控因子，其可能通過調(diào)控牙囊內(nèi)破骨前體細胞分化成熟，促進生理狀態(tài)下的骨吸收，進而導致牙齒萌出。因此，Wnt5A/Ror2信號通路在牙齒萌出過程中，具有重要的理論價值和實際意義。但Wnt5A/Ror2信號通路在牙囊內(nèi)調(diào)控破骨前體細胞分化成熟的具體分子機制尚不清楚，還有待進一步研究，為解釋牙萌出提供新的理論依據(jù)。

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（本文采編王晴）

Expression and significance of wingless-type MMTV integration site family， member 5A/receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2 in the rat dental follicle

Wang Liping， Li Boqi， Wang Qi， Tie Xiaomin， Liu Yishan.（Dept. of Pediatric Dentistry and Preventive Dentistry， The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）
Supported by: The National Natural Science Foundation of China（81560178）. Correspondence: Liu Yishan， E-mail: lys-tree @126.com.

ObjectiveTo observe the expression of wingless-type MMTV integration site family， member 5A （Wnt5A）/ receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2 （Ror2） signal in the dental follicle cells during the normal eruption of the teeth as well as to explore the relationship between the expression of dental follicle cells and the formation of mature osteoclasts and eruption of the teeth. MethodsThe mandibulars of 1-13 d old SD rats were separated to observe the growth and development of the teeth and alveolar bone through hematoxylin-eosin（HE） staining. Ror2 and Wnt5A expressions in rat dental follicle were also observed through immunohistochemistry. Dental follicle cells from the lower first intact molar germs of 5-6-day old SD rats were separated and cultured. ResultsOn the second day after birth， the dental follicle began to differentiate into periodontal tissues， but no obvious changes were observed in the alveolar bone one to three days after birth. On the fourth day， the number of osteoclasts increased significantly. The results of immunohistochemistry showed that Wnt5A was not significantly expressed in rat dental follicle tissues before the fourth day， but positive expression was expressed in the next day and continued to express to thirteenth days. Ror2 was expressed in the rat dental follicle at postnatal days 1-3， but weak expression was found in days 4-13. ConclusionWnt5A and Ror2 expressions in the process of tooth eruption have specific time distributions， suggesting that these expressions may participate in the regulation of the eruption of the teeth.

wingless-type MMTV integration site family， member 5A；receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2；dental follicle；osteoclast

R 780.2

A

10.7518/hxkq.2016.04.004

2016-01-05；

2016-05-18

國家自然科學基金（81560178）

王麗萍，碩士，E-mail:775392934@qq.com

劉奕杉，主任醫(yī)師，碩士，E-mail:lys-tree@126.com