舒端陽

(廣東省揭陽華僑高級中學 522000)

1 單酶切

由于高中生普遍沒有接觸過分子生物學，概念上比較模糊，所以高中生物學教材只介紹相對簡單的單酶切，有利于學生的理解和接受。但單酶切在實驗室操作的時候，容易出現(xiàn)反連甚至是載體之間的自連現(xiàn)象，因此單酶切的方法并非適應基因工程的所有項目。

例如，2012年高考江蘇卷第32題就涉及此問題，相關信息如下：圖1 表示含有目的基因D的DNA 片段長度(bp即堿基對)和部分堿基序列，圖2表示一種質粒的結構和部分堿基序列。現(xiàn)有MspI、BamHI、MboI、SmaI 4 種限制性核酸內切酶，它們識別的堿基序列和酶切位點分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。提出的問題是：若將圖2中質粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進行連接，形成重組質粒。但經(jīng)檢測，部分含有重組質粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達，其最可能的原因是什么？

分析：根據(jù)題意，應采用BamHI進行單酶切。所得到的目的基因D與質粒兩頭的黏性末端都是相同的。由于在進行連接反應時，目的基因和載體是隨機碰撞的，且兩者的兩端黏性末端都相同。所以，基因D既可以與質粒正向連接(正連)，即目的基因順時針地按其上游到下游的方向與載體相連(與啟動子的順時針方向一致)，這樣，目的基因就能從上游到下游正常轉錄，表達產生所需的蛋白質，產生預期的性狀；目的基因也可以與質粒反向連接(反連)，即目的基因的上下游方向顛倒地與載體相連，結果目的基因的轉錄從下游到上游，導致密碼子全部改變，目的基因不能正常表達。為了防止出現(xiàn)反連現(xiàn)象，實驗中常用雙酶切的方法。

2 雙酶切

雙酶切，即采用兩種不同的限制酶同時處理目的基因和質粒。因為限制酶具有特異性，不同的酶作用于不同的堿基序列，所以得到的黏性末端也是不同的。當應用DNA連接酶進行連接時，就只能存在一種正連情況，而不會出現(xiàn)反連的問題。正因為可以有效地防止錯誤連接的現(xiàn)象出現(xiàn)，雙酶切的做法被廣泛應用于基因工程中表達載體的構建，也可以用于制備體外轉錄的模板。

RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)引起的同源mRNA特異性降解的現(xiàn)象，可以定向地關閉某個基因的表達，因而被廣泛應用于生物學的眾多領域。要對某個基因進行有效的沉默，就需要得到與這個基因具有相同序列的dsRNA，而制備dsRNA的過程需要應用雙酶切和單酶切的處理方法。

如何制備dsRNA呢？通常要選擇一種叫做pLITMUS28i的質粒，該質粒最大的特點是帶有兩個T7啟動子，且轉錄方向是相反的，在兩個啟動子之間有一些常用的酶切位點。

首先，用雙酶切(BamHI和EcoRI)同時處理目的基因和質粒pLITMUS28i；連接后獲得重組質粒；將重組質粒平均分成兩份，分別被BamHI和EcoRI進行單酶切，獲得轉錄用的模板；加入RNA聚合酶和4種核糖核苷酸(NTP)后，在室溫下進行體外轉錄，得到單鏈RNA。因為這些單鏈RNA本身是互補的，所以低溫下退火即可制備得到dsRNA，通過脂質體轉入相應受體細胞就可用于進行RNAi的相關實驗。

圖1 含有目的基因D的DNA片段長度和部分堿基序列

圖2 一種質粒的結構和部分堿基序列