段　穎　張淑清　于俊義

(河北省衡水市第四人民醫(yī)院眼科，衡水，053000)

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丹梔逍遙散加減對(duì)肝郁氣滯型新生血管性青光眼的臨床應(yīng)用及機(jī)制探討

段穎張淑清于俊義

(河北省衡水市第四人民醫(yī)院眼科，衡水，053000)

目的：觀察丹梔逍遙散加減對(duì)肝郁氣滯型新生血管性青光眼的臨床療效及其與HIF-1/VEGF/Notch1信號(hào)通路相關(guān)性探討。方法：將42例肝郁氣滯型新生血管性青光眼患者隨機(jī)分成2組，治療組給予丹梔逍遙散加減+降眼壓藥物口服，對(duì)照組予降眼壓藥物，觀察2組治療4周后眼壓、視力、視野、新生血管回退情況等；應(yīng)用Western Blot檢測(cè)2組患者血清中HIF-1a、VEGF、Notch1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：2組經(jīng)不同方法治療4周后眼壓、視力、視野、新生血管情況比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療組經(jīng)丹梔逍遙散加減口服治療與對(duì)照組比較，HIF-1a、VEGF、Notch1的蛋白表達(dá)情況明顯低于對(duì)照組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：丹梔逍遙散加減治療新生血管性青光眼可以有效控制眼壓，提高視力、視野，促使新生血管消退，是一種安全有效的治療方式，值得臨床推廣應(yīng)用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控HIF-1/VEGF/Notch信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

丹梔逍遙散；肝郁氣滯型；新生血管性青光眼；臨床應(yīng)用；HIF/VEGF/Notch；信號(hào)通路

新生血管性青光眼(Neovascularglaucoma，NVG)是纖維血管組織在房角增生，導(dǎo)致小梁網(wǎng)阻塞，周邊虹膜前粘連和進(jìn)行性房角關(guān)閉，進(jìn)而眼壓升高進(jìn)而產(chǎn)生的一種繼發(fā)性青光眼[1]。近年來(lái)，伴隨著眼后段廣泛缺血性疾病，如糖尿病視網(wǎng)膜病變，視網(wǎng)膜靜脈阻塞、高血壓、高血脂等發(fā)病率的逐年增高，作為其主要并發(fā)癥的NVG的患病率比例也呈上升趨勢(shì)，并且是一種破壞性強(qiáng)、失明率高的眼病。目前認(rèn)為NVG的發(fā)病機(jī)制是缺血缺氧刺激引起虹膜及房角新生血管的產(chǎn)生，缺血缺氧刺激一方面引起新生血管促進(jìn)因子釋放，另一方面也活化血管抑制因子，當(dāng)促進(jìn)因子的作用大于抑制因子時(shí)，便有新生血管產(chǎn)生[2]。而在眾多的血管生長(zhǎng)因子中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在NVG的作用最令人注目。HIF-1蛋白對(duì)機(jī)體缺血缺氧具有特異性感受,缺血?jiǎng)游锬Ｐ妥C實(shí)HIF-1蛋白具有促進(jìn)新生血管形成的作用[3-4]。VEGF作為HIF-1直接調(diào)控作用的靶基因之一,兩者在缺血后血管新生過程中的關(guān)系密切。此外，大量研究表明缺氧可以提高內(nèi)皮細(xì)胞Notch信號(hào)通路的活性，同時(shí)上調(diào)VEGF等生長(zhǎng)因子在損傷部位的表達(dá),誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成新的血管組織，且認(rèn)為VEGF通過Notch信號(hào)系統(tǒng)起作用[5-7]?；谥嗅t(yī)學(xué)認(rèn)為肝郁氣滯型是本病的常見證型之一，本文旨在研究丹梔逍遙散加味治療肝郁氣滯型NVG的臨床療效，并進(jìn)一步探討其機(jī)制。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料丹梔逍遙散，高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher，美國(guó))，電泳槽(Bio-rad，美國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad，美國(guó))，Hank，S液、PMSF(碧云天，中國(guó))，SDS-PAGE電泳膠(碧云天，中國(guó))，HIF-1a、VEGF、Notch1及β-actin一抗和堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔(CST公司，美國(guó))。

1.2臨床資料

1.2.1一般資料收集2012年7月至2015年9月來(lái)我院就診的42例肝郁氣滯型NVG患者(均簽署參與本研究的知情同意書)，采用隨機(jī)數(shù)字表法將42名患者為治療組(21例)和對(duì)照組(21例)。治療組21例中男14例，女7例，平均年齡(54.1±5.76)歲，發(fā)病后青光眼病程2～13個(gè)月；對(duì)照組21例中男13例，女8例，平均年齡(55.3±6.13)歲，發(fā)病后青光眼病程2～15個(gè)月；2組患者一般資料經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2.2入選標(biāo)準(zhǔn)全部患者經(jīng)裂隙燈顯微鏡、前房角鏡等檢查證實(shí)虹膜出現(xiàn)新生血管，并伴有眼壓升高，眼壓>21 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；虹膜新生血管；房角鏡下房角關(guān)閉大于180[8]。未曾行任何手術(shù)及激光治療的NVG；自愿作為受試對(duì)象，簽署知情同意書。原發(fā)病糖尿病視網(wǎng)膜病變14例，視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞16例，視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞7例，視網(wǎng)膜血管炎5例。排除標(biāo)準(zhǔn)：心、肝、腦、腎功能不全、腫瘤及VEGF有關(guān)的疾病者；妊娠及哺乳期婦女;嚴(yán)重精神疾病患者。中醫(yī)診斷與辨證標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)眼科學(xué)》中肝郁氣滯型綠風(fēng)內(nèi)障的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。

1.2.3治療方法對(duì)照組采用降眼壓藥物治療(噻嗎心安眼水滴眼，1滴，2次/d；匹魯卡品眼水滴眼，1滴,5次/d；口服尼目克司，25 mg，2次/d)。治療組在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上加用丹梔逍遙散加減：牡丹皮、梔子、柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)各12 g，茯苓15 g，吳茱萸2 g，薄荷9 g，黃連、甘草各6 g，生姜3 g。1劑/d，每天早晚溫服2次，連用4周。

1.2.4觀察療效指標(biāo)術(shù)后觀察并記錄眼壓、視力、視野、新生血管回退情況。1)眼壓：臨床治愈：眼壓恢復(fù)低于2.74 kPa(21 mmHg)；好轉(zhuǎn)：眼壓下降至2.74～3.25 kPa(21～24 mmHg)，加用降眼壓藥物可基本正常；未愈：眼壓未降，眼部諸癥及全身癥狀無(wú)改善。2)視力：臨床治愈：視力恢復(fù)至發(fā)病前；好轉(zhuǎn)：視力恢復(fù)部分但未至發(fā)病前；未愈：視力無(wú)改善。3)視野：臨床治愈：視野恢復(fù)至發(fā)病前；好轉(zhuǎn)：視野恢復(fù)部分但未至發(fā)病前；未愈：視野無(wú)改善。4)新生血管回退：新生血管全部回退；新生血管部分回退；新生血管未回退。

1.3標(biāo)本采集和檢測(cè)方法及內(nèi)容1)血清采集：入院時(shí)第2天清晨靜息空腹?fàn)顟B(tài)下，抽取實(shí)驗(yàn)對(duì)象肘靜脈血20 mL,肝素抗凝后與等量Hallk，S液對(duì)倍稀釋充分混勻到40 mL,按照淋巴細(xì)胞分離液:抗凝血稀釋液1∶1的比例,在15 mL離心管中加入約6 mL淋巴細(xì)胞分離液，24～26 ℃水平離心2 000 r/min×20 min；離心后管內(nèi)分為五層,血漿和Hank,S液、單個(gè)核細(xì)胞(白色云霧層狹窄帶)、分離液、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞；用毛細(xì)滴管插到云霧，吸取單個(gè)核細(xì)胞,置入另一離心管中,加入5倍以上體積的Hank，S液,1 500 r/min×10 min,洗滌細(xì)胞兩次；末次離心后,棄上清,加入含有10%小牛血清的RPMI-1640,重懸細(xì)胞。根據(jù)用蛋白酶抑制劑(PMSF)法提取總蛋白。2)根據(jù)DAB方法對(duì)所提蛋白液進(jìn)行濃度測(cè)定后于100 ℃金屬浴中變性。3)每泳道上樣量為50 μg蛋白；電泳(4%濃縮膠，12%分離膠，120 V，50 mA，1.5 h)結(jié)束后將凝膠取出，用聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)印，50 V，100 mA，2 h。5%脫脂奶粉液的封閉2 h，TBS清洗，分別加入稀釋的抗HIF-1a、VEGF、Notch1和β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBS清洗，加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG，1∶2 000)室溫2 h，TBS清洗。將濾膜放于顯色液中顯色后顯影，圖像由生物分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司，Model Gel Doc 2000，美國(guó))分析處理。

2　結(jié)果

由表1可知，2組經(jīng)不同方法治療4周后眼壓、視力、視野、新生血管情況比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05;由圖1可知，治療組經(jīng)丹梔逍遙散加減口服治療4周后與對(duì)照組比較，HIF-1a、VEGF、Notch1的蛋白表達(dá)情況明顯低于對(duì)照組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

表1　2組眼壓、視力、視野、新生血管情況情況分析對(duì)比

2組治療后眼壓、視力、視野、新生血管情況比較：χ2分別為7.29、11.98、8.77、3.65,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1　2組HIF-1a、VEGF、Notch1的蛋白表達(dá)情況

表2　2組HIF-1a、VEGF、Notch1的蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3　討論

NVG是一種病情重且極難治性的繼發(fā)性青光眼，其致盲率高達(dá)92.4%[10]。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的飛速發(fā)展，眼部新生血管的相關(guān)研究已成為國(guó)內(nèi)外眼科專家的熱點(diǎn)研究，其中，以研究觀察HIF-1、VEGF的表達(dá)情況及機(jī)制最為多見。組織缺血缺氧后HIF-1作為血管新生的核心調(diào)控因子對(duì)血管新生具有重要作用，主要通過以下機(jī)制發(fā)揮作用:1)上調(diào)VEGF受體、配體以及NO，使血管通透性增加為血管形成作好準(zhǔn)備；2)降解細(xì)胞外基質(zhì)同時(shí)增加金屬蛋白水解酶活性為細(xì)胞的存活提供環(huán)境；3)通過VEGF和整合素使血管內(nèi)皮細(xì)胞由血管芽腔形成血管網(wǎng)；4)最后通過血管生成素、血小板衍生生長(zhǎng)因子等作用于基質(zhì)細(xì)胞，使新生血管進(jìn)一步成為成熟血管[11-12]。VEGF是目前所發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)、最直接的血管形成促進(jìn)因子，被公認(rèn)為血管生成過程中的中心調(diào)節(jié)者[13]。有研究表明，NVG的發(fā)病與視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF表達(dá)增加，眼內(nèi)VEGF濃度增高密切相關(guān)[14]。趙君[15]等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠角膜堿燒傷后的預(yù)后與異常增生的微血管有關(guān)，VEGF、HIF-1二者間的動(dòng)態(tài)平衡的失調(diào)促進(jìn)角膜組織中的微血管形成。Notch受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了新生血管的形成。Hainaud等[16]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎模型中注射VEGF的激活劑使VFGF的表達(dá)上調(diào)，VFGF的表達(dá)上調(diào)引起Notch信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子的活化，促進(jìn)血管生成；此研究表明Notch信號(hào)通路是VEGF的下游靶點(diǎn)，兩者共調(diào)控新生血管的形成與成熟過程，在血管新生方面發(fā)揮重要作用。

中醫(yī)學(xué)對(duì)青光眼已有深刻的認(rèn)識(shí)，認(rèn)為青光眼屬“綠風(fēng)內(nèi)障”和“青風(fēng)內(nèi)障”范疇，是由肝氣郁滯、脾濕生痰、肝膽火熾、陰虛陽(yáng)亢等致氣血失和所致。近代醫(yī)家認(rèn)為本病多由內(nèi)傷七情所致。七情所傷，最易傷氣，氣傷影響及血，使氣血同時(shí)受病，上亂清道，蒙蔽空竅而發(fā)病。丹梔逍遙散出自《內(nèi)科摘要方》，主要用于治療肝氣郁結(jié)、肝血不足、虛熱內(nèi)生的病癥。方中以柴胡做為君，疏肝解郁，使肝氣調(diào)達(dá)；白芍性酸苦微寒，養(yǎng)血斂陰，柔肝緩急。當(dāng)歸味辛散，養(yǎng)血和血，乃血中氣藥。當(dāng)歸與白芍同用，補(bǔ)肝體而調(diào)肝用，使血和則肝和，血充則肝柔共為臣藥。木郁則土衰，肝病易傳脾，故以白術(shù)、茯苓、甘草健脾益氣，共為佐藥。再加用牡丹皮清血中之伏火，梔子清肝熱、瀉火除煩、導(dǎo)熱下行。諸藥合用，共奏疏肝解郁、健脾涼血之效，成為治療青光眼肝郁證型的有效方劑[17]。

本文通過對(duì)比治療發(fā)現(xiàn)2組不同方法治療4周后，治療組經(jīng)丹梔逍遙散加減口服治療與對(duì)照組比較，眼壓、視力、視野、新生血管情況比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2組血清提取單核細(xì)胞檢測(cè)HIF-1a、VEGF、Notch1的蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示，治療組的HIF-1a、VEGF、Notch1的蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜述表明丹梔逍遙散加減治療NVG可以有效控制眼壓，提高視力、視野，促使新生血管消退，是一種安全有效的治療方式，值得臨床推廣應(yīng)用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控HIF/VEGF/Notch信號(hào)通路來(lái)抑制血管新生的過程，但具體調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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(2016-01-04收稿責(zé)任編輯：徐穎)

Clinical Application of Danzhi Xiaoyao Powder in Treating Neovascularglaucoma of Qi Stagnation due to Depression of Liver and Its Mechanism

Duan Yin, Zhang Shuqing, Yu Junyi

(OphthalmologyDepartment,Fourthpeople′shospital,Hengshui053000,China)

Objective: To observe clinical curative effect of Danzhi Xiaoyao Powder in the therapy of ganyu qizhi type of neovascularglaucoma(NVG) and deeply investigate the relationship between this effect and HIF-1/VEGF/Notch1 pathway. Methods: A total of 42 patients NVG were randomly divided into into 2 groups，21 patients in treatment group were treated with modified Danzhi Xiaoyao Powder and iop drugs，21 patients in control group were treated with only iop drugs.Observe the two groups after treatment of 4 weeks, intraocular pressure, visual ，view and new blood vessels.The expression of HIF-1a、VEGF、Notch1 at the protein level was assessed by Western Blot．Results: Significant differences were observed in terms of intraocular pressure, visual, view and new blood vessels (P<0.05). Compared with the control group, the expression of HIF-1a, VEGF, Notch1 level in the treatment group were significantly decreased (P<0.05). Conclusion: Danzhi Xiaoyao Powder in the treatment of NVG may effectively control the intraocular pressure, improve eyesight and restrain new blood vessels. It is a safe and effective treatment, worthy of clinical popularization and application. Its mechanism may be related to the regulation of HIF-1/VEGF/Notch1 signaling pathway.

Danzhi xiaoyao Powder; Qi stagnation due to depression of liver pattern; NVG; HIF-1/VEGF/Notch1 signaling pathway; Clinical effect

衡水市科技局科研項(xiàng)目(編號(hào)：14035A)

段穎(1981.03—)，女，大學(xué)本科,主治醫(yī)師，研究方向：眼科常見病及多發(fā)病的診斷與治療，E-mail：13315820033@163.com

R242;R246.82

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.034