蔡婧 袁瓊嘉

60min/d游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腦衰老和海馬GAP-43表達(dá)的影響

蔡婧 袁瓊嘉

目的：探討60min/d游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)D-半乳糖致大鼠腦衰老和海馬GAP-43表達(dá)的影響。方法：將42只SD大鼠隨機(jī)分為：0.9%Nacl對(duì)照組（Na），衰老組（D），運(yùn)動(dòng)干預(yù)組（Ds），n=14。測(cè)定大腦皮質(zhì)GSH-Px、SOD活性和MDA含量，Western blotting檢測(cè)海馬GAP-43蛋白表達(dá)。結(jié)果：D組較Na組行動(dòng)遲緩，精神不振且嗜睡，皮毛無光澤、卷曲枯黃且伴有嚴(yán)重脫落等衰老體癥明顯；D組與Na組相比GSH-PX、SOD活性非常顯著性降低（P＜0.01），MDA含量非常顯著升高（P＜0.01）；Ds組GSHPX活性顯著性高于D組（P＜0.05），SOD活性非常顯著性高于D組（P＜0.01），MDA含量非常顯著性低于D組（P＜0.01）；Ds組和Na組GSH-PX、SOD活性和MDA含量均無顯著性差異（P＞0.05）。D組海馬GAP-43蛋白表達(dá)量非常顯著性低于Na組（P＜0.01）；Ds組海馬GAP-43蛋白表達(dá)量非常顯著性高于D組（P＜0.01）；Ds組海馬GAP-43蛋白表達(dá)量顯著性低于較Na組（P＜0.05）。結(jié)論：（1）注射D-半乳糖（100mg/kg/d）6周，可以建立大鼠腦衰老模型。（2）在大鼠衰老過程中進(jìn)行60min/d游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以延緩腦衰老，減緩海馬GAP-43蛋白表達(dá)量的下調(diào)。

有氧運(yùn)動(dòng)；衰老；海馬；GAP-43；大鼠

10.16730/j.cnki.61-1019/g8.2016.08.092

學(xué)習(xí)記憶能力會(huì)隨著腦的衰老而逐漸減退［1］。自由基學(xué)說是目前公認(rèn)的衰老學(xué)說之一［2］。有氧運(yùn)動(dòng)能提高機(jī)體清除自由基的能力，延緩衰老［3］。海馬與空間學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)［4］。GAP-43不僅對(duì)神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)、發(fā)育和軸突的再生以及突觸功能的維持等方面起著重要的作用，而且還參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放［5］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用D-半乳糖致大鼠腦衰老［6］。在大鼠腦衰老過程中經(jīng)行60min/d游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)，觀察60min/d游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腦衰老和海馬GAP-43表達(dá)的影響，從分子水平探討60min/d游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)腦衰老的影響機(jī)制。

1.材料與方法

1.1造模和取材

42只4月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重400±20g，購(gòu)于成都達(dá)碩生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證CSXK（川）2008-24。

自由飲食，光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為：0.9%Nacl對(duì)照組（Na），衰老組（D），運(yùn)動(dòng)干預(yù)組（Ds）（見表1）。

表1　分組造模

Na組每日9：00注射0.9%Nacl（2ml/kg/d），共6周；D組和Ds組每日注射5%D-半乳糖，注射時(shí)間和計(jì)量同Na組；Ds組每日注射5%D-半乳糖的同時(shí)，19：00進(jìn)行60mim/d的游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（水深80cm，水溫34±2℃），每周訓(xùn)練6天。6周后，斷頭取腦，剝離海馬和大腦皮質(zhì)用凍存管分裝入液氮罐保存。

1.2自由基指標(biāo)檢測(cè)

考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)大腦皮質(zhì)蛋白總量；微量還原型谷胱甘肽測(cè)定試劑盒和超氧化物歧化酶（SOD）WST -1法測(cè)定試劑盒檢測(cè)谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物岐化酶（SOD）活性；丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒檢測(cè)丙二醛（MDA）含量。具體實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3western blot檢測(cè)

海馬組織按1mg：20 μl裂解液比例勻漿提取樣品基因總蛋白；總蛋白濃度用碧云天BCA蛋白濃度測(cè)試試劑盒測(cè)定；蛋白變性；蛋白樣品SDS-PAGE凝膠電泳至分離，轉(zhuǎn)印PVDF膜，8%脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗（ab9018），濃度：1：1000，4℃孵育過夜；二抗（山羊抗小鼠lgG/辣根酶標(biāo)記），濃度：1：2000，37℃孵育2h；暗室顯影、定影。Quantity One分析軟件，條帶軌跡定量分析法（TraceTracking）分析條帶灰度值，與βactin掃描值相比，以其比值作為目的蛋白的表達(dá)量［7］

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS17.0分析得出結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析組間比較，P＜0.05表示具有顯著性意義，P＜0.01表示具有非常顯著性意義。

2.結(jié)果

2.1大鼠狀態(tài)觀察

表3　各組大鼠大腦皮質(zhì)GSH-Px、SOD活性和MDA含量（X±S，n=6）

D組大鼠行動(dòng)遲緩，精神不振且嗜睡，皮毛無光澤、卷曲枯黃且伴有嚴(yán)重脫落。Na組與D組相比，精神狀態(tài)良好且行動(dòng)敏捷、毛發(fā)富有光澤。

2.2自由基檢測(cè)結(jié)果

2.3海馬GAP-43 western-blotting檢測(cè)結(jié)果

圖1　各組GAP-43基因蛋白表達(dá)量

3.討論

3.1大鼠腦衰老模型驗(yàn)證

GSH-PX、SOD等協(xié)同可以將大部分O-2反應(yīng)掉，是體內(nèi)清楚自由基的主要酶類［8］。但是隨著年齡的遞增，不斷的衰老，GSH-PX、SOD的合成會(huì)逐步減少；活性也會(huì)降低，導(dǎo)致過氧化物在體內(nèi)大量的堆積，使體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平升高［9］。本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物腹腔注射D-半乳糖致衰老［1 0］，發(fā)現(xiàn)D組大鼠行動(dòng)遲緩，精神不振且嗜睡，皮毛無光澤、卷曲枯黃且伴有嚴(yán)重脫落等衰老體癥。Na組大鼠精神狀態(tài)良好且行動(dòng)敏捷、毛發(fā)富有光澤。一般狀態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，D組表現(xiàn)出明顯的衰老癥狀。通過自由基檢測(cè)，D組大鼠大腦皮質(zhì)GSHPX和SOD活性顯著性低于Na組（P＜0.01）；MDA含量顯著性高于N組（P＜0.01）。研究結(jié)果證明本次連續(xù)6周腹腔注射D-半乳糖造腦衰老模型成功。

3.2有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腦GSH-PX、SOD活性和MDA含量的影響

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練一方面能夠有效地提高機(jī)體清除自由基的能力，另一方面又會(huì)致機(jī)體生成自由基［1 1］。本次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用60min/d無負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)的手段干預(yù)D-半乳糖致衰老過程，檢測(cè)大鼠腦GSH-PX、SOD活性和 MDA含量。結(jié)果顯示：Ds組與D組相比較GSH-PX活性顯著性提高（P＜0.05）；SOD活性非常顯著性提高（P＜0.01），而Ds組MDA含量非常顯著性的低于D組（P＜0.01）。Ds組在衰老的過程進(jìn)行了60min/ d游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)有效地增強(qiáng)了大腦GSH-PX、SOD的活性，同時(shí)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量也被降低了。與6周跑臺(tái)訓(xùn)練可以提高大腦皮層和海馬的GSH-PX、SOD的活性，降低MDA、LPO的含量［1 2］。以及適度的有氧運(yùn)動(dòng)可以提高大腦的抗氧化能力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［1 3、1 4、1 5］，等結(jié)論一致。

3.3有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬GAP-43表達(dá)的影響

GAP-43是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和軸突再生的關(guān)鍵［16］，學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)是突觸可塑性，其典型的表現(xiàn)是LTP的形成，GAP-43在此過程中起著重要的作用。本研究結(jié)果顯示：D組與Na組相比較海馬GAP-43蛋白表達(dá)水平非常顯著性降低（P＜0.01），說明大腦衰老后，海馬GAP-43蛋白的表達(dá)水平顯著下降。Ds組與D組相比海馬GAP-43蛋白表達(dá)水平非常顯著性上調(diào)（P＜0.01），Ds組與Na相比海馬GAP-43蛋白表達(dá)水平顯著性下降（P＜0.05）。提示衰老過程中經(jīng)行60min/d游泳運(yùn)動(dòng)即有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以有效地控制海馬GAP -43蛋白表達(dá)水平的下降，是降低大鼠衰老過程中學(xué)習(xí)記憶能力衰退的機(jī)制之一。

4.結(jié)論

4.1注射D-半乳糖（100mg/kg/d）6周，可以成功建立大鼠腦衰老模型。

4.2大鼠衰老過程中進(jìn)行60min/d游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以延緩腦衰老，減緩海馬GAP-43基因mRNA和蛋白表達(dá)量的下調(diào)。可能是延緩大鼠衰老過程中學(xué)習(xí)記憶能力衰退的機(jī)制之一。

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國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：31371202）；四川省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2012SZ0067）；國(guó)家體育總局、四川省運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室＂四川省高?？蒲袆?chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)基金研究成果＂。

蔡 婧（1985-），女，江西大余人，碩士研究生，研究方向：運(yùn)動(dòng)與健康促進(jìn)，運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)，私立華聯(lián)學(xué)院；袁瓊嘉（1956-），女，重慶市人，研究方向：體育運(yùn)動(dòng)與健康促進(jìn)、運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)，教授，成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)系。（通訊作者）