帥江冰　　吳姍　　虞惠貞　　何永強(qiáng)　　張曉峰

（浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院　　浙江杭州　310016）

浙江地區(qū)豬戊型肝炎病毒全基因組序列分析

帥江冰吳姍虞惠貞何永強(qiáng)張曉峰*

（浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院浙江杭州310016）

采用套式RT-PCR方法首次對(duì)浙江省豬群中戊型肝炎病毒的全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增，并對(duì)其兩端非編碼區(qū)采用末端快速擴(kuò)增法進(jìn)行擴(kuò)增，T-A克隆測(cè)序后拼接分析。JH-14-03株全基因組共7253 bp，5’端至3’端依次為 5’非編碼區(qū)（25 bp）、ORF1基因（5124 bp）、ORF3基因（339 bp）、ORF2基因（1983）及包含一個(gè)18個(gè)堿基A組成的Poly（A）尾的3’非編碼區(qū)（86 bp）。JH-14-03株戊型肝炎病毒與已發(fā)表的基因4型戊型肝炎病毒全基因組核苷酸同源性最高，為85.6%-94.7%，顯著高于與基因1、2、3型已發(fā)表戊型肝炎病毒全基因序列的同源性。分子進(jìn)化分析顯示JH-14-03株與大部分國(guó)內(nèi)豬源和人源戊型肝炎病毒同屬于戊型肝炎病毒基因4型毒株。

戊型肝炎病毒；全基因組序列分析

1　　前言

戊型肝炎（Hepatitis E）由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起，是一種經(jīng)糞-口傳播、以黃疸為主的急性傳染?。?］。戊型肝炎的病死率較甲、乙、丙型和丁型肝炎高，其中患病孕婦的病死率可高達(dá)21%［2，3］。自1955年印度發(fā)生第1次大暴發(fā)以來(lái)，戊型肝炎已在亞洲、非洲與拉丁美洲的很多國(guó)家廣泛流行［4］，近年來(lái)亦在日本等發(fā)達(dá)國(guó)家散發(fā)流行［5］。我國(guó)是戊型肝炎高發(fā)區(qū)，新疆、遼寧、山東等省均有流行［3，6］，對(duì)公共衛(wèi)生和人類健康構(gòu)成了極大威脅。

HEV基因組為單股正鏈RNA，約7.3 kb，依次包含5’非編碼區(qū)、3個(gè)部分重疊的開放讀碼框（ORF）以及3’端非編碼區(qū)和一個(gè)polyA尾［7］。自Meng等［8］1997年首次分離鑒定豬戊型肝炎病毒 （sHEV）以來(lái)，越來(lái)越多的研究表明豬源HEV與人源HEV基因組具有很高的同源性，在遺傳進(jìn)化關(guān)系上也有較高的親緣性［9-10］。豬源HEV能通過人工接種感染黑猩猩等靈長(zhǎng)類動(dòng)物；人HEV也能成功感染豬等動(dòng)物［11，12］。因此，戊型肝炎被認(rèn)為是人畜共患性疾?。?2，13］。種系進(jìn)化研究表明不同地區(qū)來(lái)源的HEV基因組序列存在一定差異，可被劃分成4個(gè)主要的基因型［14］。其中基因1型和2型僅分離于人類，大規(guī)模戊肝暴發(fā)流行均為此類HEV引起；基因3型和4型見于小規(guī)模流行和臨床散發(fā)，能感染多種哺乳動(dòng)物［15］，并已有生食鹿肉和豬肉導(dǎo)致此類HEV感染的報(bào)道［16，17］，此類HEV的主要天然宿主為豬。我國(guó)流行的HEV毒株則主要為1型和4型［18］，近年來(lái)，在我國(guó)上海、浙江等地區(qū)的豬群中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了HEV 3感染［19，20］。本研究在浙江省豬群中HEV流行分布及其特征分析的基礎(chǔ)上，對(duì)來(lái)源于豬糞便中的JH-14-03 HEV毒株進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增分析，以進(jìn)一步分析浙江省HEV的基因結(jié)構(gòu)、準(zhǔn)確定型，便于深入了解解人源HEV與豬源HEV遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2　　材料與方法

2.1材料

2.1.1試劑

AmbionMagMAX-96TMViralRNAIsolationKit：Lifetechnologies，美國(guó)；SMART 5’RACE試劑盒：Clonetech，美國(guó)；DEPC水 （試劑純）、Prime-ScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、3'RACE試劑盒：大連寶生物公司。

2.1.2儀器

全自動(dòng)核酸提取儀：Thermofisher Kingfisher Flex，美國(guó)；PCR儀：Biometra T3000，德國(guó)。

2.1.3樣本來(lái)源

HEV病毒株JH-14-03：2014年采集自浙江省某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)豬糞便，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)為HEV RNA陽(yáng)性。

2.2方法

2.2.1RNA提取

取1-2 g糞便樣品，加入0.02 M PBS，徹底混勻制成20%的懸液（w/v）；10000 r/min離心20 min，小心吸取上清，按Ambion MagMAX-96TM Viral RNA IsolationKit說明并使用全自動(dòng)核酸提取儀提取RNA，最后加入40 μL DEPC水洗脫，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2HEV全基因擴(kuò)增

參照已發(fā)表的HEV各基因型序列，設(shè)計(jì)10對(duì)引物用于套式PCR分段擴(kuò)增基因組序列（圖1，表1）。提取的 RNA按 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA：首先取抽提的RNA 8 μL，分別加入表1中各擴(kuò)增片段外側(cè)引物的下游引物1 μL（20 μM）和dNTP 1 μL（10 mM），65℃處理5 min，立即冰浴。隨后加入RT-buffer 4 μL，Rnasin 0.5 μL（40 U/μL），PrimeScript Rnase 1 μL （200 U/μL），雙蒸水4.5 μL，42℃水浴1.5 h，70℃滅活15 min。直接取cDNA產(chǎn)物6 μL以各片段的外側(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為95℃ 5 min、94℃ 1min、52℃ 30 s、72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10 min。取4 μL第一輪PCR產(chǎn)物以各片段的內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第二輪PCR，反應(yīng)體系和條件同第一輪PCR。

圖1HEV全基因組分段PCR擴(kuò)增示意圖

表1　HEV全基因組套式PCR分段擴(kuò)增引物及其堿基位點(diǎn)

（續(xù)表1）

2.2.3末端快速擴(kuò)增法（RACE）

5’RACE按 CLONTECH 公 司 SMART5’RACE試劑盒說明進(jìn)行，其中以片段1外側(cè)引物作為基因特異性下游引物（表1）。

3’RACE按照TaKaRa試劑盒說明進(jìn)行，用片段10引物作為基因特異性上游引物進(jìn)行半套式反應(yīng)。

2.2.4序列分析

分別將10段產(chǎn)物T-A克隆后送往上海英駿公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果拼接后，利用CLUSTAL X（1.83）將其與國(guó)內(nèi)外其他地區(qū)的HEV毒株ORF2序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，然后分析不同基因片段中發(fā)生突變的位點(diǎn)。利用軟件 MolecularEvolutionary Genetics Analysis（MEGA，version 3.1）進(jìn)行分子進(jìn)化關(guān)系分析。

HEV氨基酸位點(diǎn)的選擇壓力通過 MEGA （version 5.1）軟件在Muse-Gaut密碼子替換模型的基礎(chǔ)上，以最大似然法進(jìn)行進(jìn)化分析。以標(biāo)準(zhǔn)化的非同義突變（dN）和同義突變（dS）的差值作為進(jìn)化壓力的判斷指標(biāo)，即當(dāng)dN-dS大于0表示位點(diǎn)發(fā)生的是正性選擇；若dN-dS小于0表示位點(diǎn)發(fā)生的是負(fù)性選擇；dN-dS等于0表示位點(diǎn)受中性選擇的作用。同時(shí)對(duì)位點(diǎn)突變是否符合中性突變進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，若p大于0.05則符合零假設(shè)，即位點(diǎn)的突變符合中性突變。

3　　結(jié)果

3.1HEV基因結(jié)構(gòu)

豬源HEV 4毒株JH-14-03株全基因組共7253 bp，5’端至3’端分別為：25個(gè)核苷酸組成的5’非編碼區(qū)（1-25 nt），全長(zhǎng)5124 bp的ORF1基因（26-5149 nt），339 bp的ORF3基因（5174-5512 nt），1983 bp的ORF2基因（5185-7167 nt）以及一段86 bp的包括18個(gè)堿基A組成的PolyA尾的3’非編碼區(qū) （7167-7253 nt）。JH-14-03株HEV ORF1和ORF2基因不重疊，ORF3與ORF2基因部分重疊。

3.2HEV基因序列分析

將JH-14-03全基因組與Genebank中已發(fā)表的HEV全序列比對(duì)，結(jié)果顯示JH-14-03株HEV與已發(fā)表的基因4型HEV全基因組苷酸同源性較高，為85.6%-94.7%（表2），顯著高于與基因1、2、3型已發(fā)表HEV全基因序列的同源性。從ORF序列比對(duì)結(jié)果來(lái)看，ORF1相對(duì)最為保守，大部分毒株間ORF1同源性要高于ORF2和ORF3基因同源性。

表2　HEV JH-14-03分離株與已發(fā)表的不同型HEV全基因組序列比對(duì)分析（%）

JH-14-03毒株ORF1基因編碼1708個(gè)氨基酸，與4型HEV ORF1同源性較高，部分毒株可高達(dá)90%以上（表2）。進(jìn)一步結(jié)合已發(fā)表的HEV全基因序列對(duì)ORF1核苷酸點(diǎn)突變進(jìn)行分析，結(jié)果表明，ORF1點(diǎn)突變位點(diǎn)較為均衡的散步分于整個(gè)基因中，其中以3000-3500 nt區(qū)域發(fā)生頻率最高。選擇壓力分析顯示HEV ORF1雖然有較多位點(diǎn)dN-dS值大于0（圖2），但均接受零假設(shè)（p大于0.05），其進(jìn)化壓力以中性選擇為主。

圖2　HEV 4 ORF 1基因氨基酸位點(diǎn)dN-dS值（1-400 aa）

JH-14-03株ORF 2基因序列均為1983 bp，與HEV 1、HEV 2、HEV3和HEV4參考序列的核苷酸同源性分別73.5-75.3%、71.2%、73.4-76.3%、5.7-91.6%，與HEV 4型參考序列同源性最高。JH-14-03株ORF 2編碼661個(gè)氨基酸，與已發(fā)表的HEV 4毒株進(jìn)行選擇壓力分析其后發(fā)現(xiàn)其中有2個(gè)位點(diǎn)dN-dS值大于0（圖3）：第67位的賴氨酸，dN-dS為0.29；第208位的苯丙氨酸，dN-dS為0.16，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明p分別為0.356和0.529，因此，不能認(rèn)為這兩個(gè)位點(diǎn)在進(jìn)化時(shí)受正性選擇的作用。其余大多數(shù)氨基酸位點(diǎn)的dN-dS值小于0，但其統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果為零假設(shè) （p大于0.05）。綜上所述，HEV 4 ORF2蛋白位點(diǎn)同義替換率和非同義替換率相似，其進(jìn)化壓力以中性選擇為主。

圖3　HEV 4 ORF2基因氨基酸位點(diǎn)dN-dS值（1-228 aa）

JH-14-03毒株ORF 3基因含339個(gè)核苷酸，編碼112個(gè)氨基酸，與部分日本人源HEV和中國(guó)豬源HEV一致，但與大多數(shù)人源HEV和部分中國(guó)豬源HEV相比少了一個(gè)編碼氨基酸。

3.3非編碼區(qū)序列分析

已報(bào)道的HEV全基因組5’編碼區(qū)序列從9個(gè)堿基到33個(gè)堿基不等，但未見特征性報(bào)道。JH-14-03的5’非編碼區(qū)分別為25 bp，比對(duì)后顯示各地區(qū)均有與本研究毒株相似類型的HEV毒株。JH-14-03的3’非編碼區(qū)不包括PolyA尾為68 bp，與已發(fā)表HEV毒株3’非編碼區(qū)同源性比對(duì)結(jié)果與全基因組或ORF同源性比對(duì)結(jié)果一致，即JH-14-03與4 型HEV同源性高。JH-14-03的3’非編碼區(qū)還含有18個(gè)PolyA尾，有報(bào)道稱RNA病毒的PolyA尾長(zhǎng)短與病毒致病性強(qiáng)弱可能存在一定的關(guān)系，但具體相關(guān)性還未見清晰證明。

3.4全基因組分型

將JH-14-03全基因組序列與其他各型HEV毒株序列比對(duì)后構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示可以分為明顯的4支。JH-14-03分布于4型分支中，與中國(guó)豬源HEV毒株親緣性較近。與以O(shè)RF2構(gòu)建的進(jìn)化樹一致，日本毒株構(gòu)成了相對(duì)獨(dú)立的一個(gè)小分支，表現(xiàn)出一定的地區(qū)聚集性。進(jìn)化樹分型顯示豬源HEV與人源HEV均散布于3型和4型分支中，親緣性較高，未出現(xiàn)明顯的種間聚集。

圖4　HEV JH-14-03分離株全基因序列分子進(jìn)化關(guān)系分析

4　討論

本研究首次報(bào)道了浙江省豬源HEV JH-14-03株全基因組序列。與已報(bào)道的其他豬源或人源HEV分離株全序列進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，JH-14-03株與HEV 4同源性最高，但也存在大量的核苷酸突變。JH-14-03全基因組包含兩個(gè)非編碼區(qū)和3個(gè)主要ORF，其基因結(jié)構(gòu)均與大部分HEV 4一致。對(duì)ORF1 和ORF 2基因每個(gè)氨基酸位點(diǎn)的選擇壓力分析發(fā)現(xiàn)，雖然有部分位點(diǎn)的dN-dS值大于0，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此本研究認(rèn)為HEV 4 ORF1和ORF2在進(jìn)化過程中主要受中性選擇的作用。由于同義替換不受自然選擇作用，所以在排除其他干擾因素的情況下，許多基因位點(diǎn)的同義替換速率往往相似且保持穩(wěn)定。

病毒基因組不同位點(diǎn)按照不同的突變結(jié)果，表現(xiàn)出不同的突變率。HEV基因的突變以第三密碼子的同義突變?yōu)橹?，這可能由于非同義突變的位點(diǎn)往往受到功能限制而導(dǎo)致其突變率較低。但由于病毒的遷移、急性散發(fā)和重組適應(yīng)等進(jìn)化因素，造成了更多位點(diǎn)的同義突變。同時(shí)不同基因型由于宿主范圍的原因，其突變率也有所差別。由于動(dòng)物宿主的生長(zhǎng)周期要明顯短于人類，因此存在于動(dòng)物宿主的HEV的生存壓力要大于人，導(dǎo)致其快速突變，以增強(qiáng)適應(yīng)性，進(jìn)而導(dǎo)致HEV 3和HEV 4的突變率要高于HEV 1。

本研究對(duì)HEV全基因組分型分析后顯示JH-14-03株分布于HEV 4型分支中，與核苷酸同源性分析結(jié)果一致。分子進(jìn)化分析顯示只有部分日本HEV毒株顯示了一定的地區(qū)聚集性，其余不同地區(qū)的人源和豬源HEV均散布不同型分支中，未表現(xiàn)出明顯的地區(qū)差異，提示大部分地區(qū)HEV毒株尚未進(jìn)化形成明顯的特征，但也可能是HEV毒株跨地區(qū)遷移、傳播的結(jié)果。豬源HEV與人源HEV均散布于3型和4型分支中，親緣性較高，未出現(xiàn)明顯的種間聚集，提示HEV在人、豬等物種間跨物種傳播的可能性［12，13］。有報(bào)道還顯示有人因食用了野豬肉和鹿肉而引起急性戊肝［16，17］，說明戊型肝炎病毒可能在自然狀態(tài)下或通過食物等在動(dòng)物和人之間傳播。此外，與豬頻繁接觸的人群（如飼養(yǎng)員、獸醫(yī)、屠工）中戊型肝炎病毒的抗體水平明顯高于正常人群，也提示豬HEV可能交叉感染人類［11］。因此，HEV被認(rèn)為在某些地區(qū)可跨越種間屏障，相互傳播，但傳播機(jī)制如何，還有待于進(jìn)一步研究。

5　　結(jié)論

本研究首次分析了浙江省豬群中基因4型戊型肝炎病毒的全基因組序列，全長(zhǎng)7253 bp，包含兩個(gè)非編碼區(qū)和3個(gè)主要ORF，其基因結(jié)構(gòu)與大部分HEV 4一致，但存在大量的核苷酸突變。

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Full Genome Sequence Analysis of Swine Genotype 4 Hepatitis E Virus Isolated from Zhejiang

SHUAI Jiangbing，WU Shan，YU Huizhen，HE Yongqiang，ZHANG Xiaofeng*
（Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine，Hangzhou，Zhejiang，310016）

The full-length genomic sequence of a swine hepatitis E virus（HEV）isolate（JH-14-03）isolated from feces of pig in Zhejiang province was determined.The complete genome of 7253 nucleotides consisted of 5’non-coding region，ORF1，ORF3，ORF2 and 3’non-coding region that including poly（A）tail of 18 residues.Comparative full-length genome sequence revealed that sequence of JH-14-03 was closely related to other HEV isolates published in NCBI with identity of 85.6%-94.7%.Phylogenetic analysis suggested that the isolate JH-14-03 clustered in group 4 with most of published swine and human HEV isolates.

Hepatitis E Virus；Full Genome Sequence Analysis

S851.34

E-mail：sjb@ziq.gov.cn；*通信作者Email：zxf@ziq.gov.cn

浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2015C02G4130003）；國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目 （2013IK046）

2015-12-28